李傳棠，吳嘉俊，鄒爭志

（1.廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州511300；2.華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510631；3.華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，廣東省激光生命科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510631）

乳腺癌擴(kuò)增因子（amplified in breast cancer 1，AIB1）又稱 NCOA3、SRC3、p/CIP、RAC3、ACTR、TRAM-1，屬于核受體共激活因子（nuclear receptor coactivator，NCOA）家族，是一類相對(duì)分子質(zhì)量約為160的輔激活因子，主要功能為與核受體結(jié)合并調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[1]。該家族主要包括3個(gè)成員，分別是NCOAl、NCOA2、NCOA3。研究表明，NCOA家族與一些疾病的形成和發(fā)展有重要的關(guān)系，目前該家族蛋白作為疾病治療的靶點(diǎn)越來越受到重視，且開發(fā)出來的相應(yīng)的靶向藥物已開展臨床試驗(yàn)。aib1是一個(gè)重要的癌基因，關(guān)于其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的功能報(bào)導(dǎo)較多?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)aib1基因在乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌以及前列腺癌等多個(gè)激素相關(guān)的腫瘤中高度擴(kuò)增，其蛋白表達(dá)也顯著升高[2-4]。在非激素相關(guān)腫瘤（如食道癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、泌尿道腫瘤、肝細(xì)胞癌及白血?。┲芯l(fā)現(xiàn)AIB1的高表達(dá)和擴(kuò)增[5-6]。

Li等[4]研究表明，AIB1能與一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，通過激活或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。如其與E2F轉(zhuǎn)錄因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）、激活蛋白 1（activated protein-1，AP-1）、核因子 κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活劑6（signal transducers and activators of transcription 6，STAT6）等轉(zhuǎn)錄因子相互作用，可調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，P13K/AKT）、胰島素樣生長因子 -1（insulin-like growth factor 1，IGF-l）等信號(hào)通路來控制腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡。Song等[6]研究發(fā)現(xiàn)，AIB1通過與星形膠質(zhì)細(xì)胞磷酸化蛋白 3（phosphoprotein enriched in astrocytes，PEA-3）和AP-1等相互作用，促進(jìn)了基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）家族蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在乳腺癌和肺癌中靶向抑制AIB1能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的活力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且與組蛋白去乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑聯(lián)合使用具有協(xié)同抗腫瘤作用。另外，Wang等[7]發(fā)現(xiàn)，AIB1促進(jìn)了乳腺癌對(duì)化療藥紫杉醇產(chǎn)生耐藥，且在耐藥的乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)。其機(jī)制在于，AIB1作為核受體亞家族5，A組，成員2（nuclear receptor subfamily 5 group A member 2，NR5A2）的激活子協(xié)同誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞mdc1基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)修復(fù)化療誘導(dǎo)的DNA損傷，導(dǎo)致乳腺癌化療耐藥。

在本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)AIB1與卵巢癌患者的預(yù)后相關(guān)。通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫可知，aib1基因表達(dá)高的卵巢癌患者和順鉑治療后的卵巢癌患者的總生存期（overall survival，OS）、進(jìn)展后生存期（post progression survival，PPS）以及無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）均顯著降低。在卵巢癌細(xì)胞中的試驗(yàn)結(jié)果也表明，AIB1促進(jìn)細(xì)胞對(duì)順鉑的抵抗?？傊?，AIB1能影響卵巢癌的預(yù)后且增強(qiáng)卵巢癌對(duì)順鉑抵抗。

1 材料與方法

1.1 材料

順鉑（cisplatin or cis-dichlorodiammine platinum，DDP）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購買于 Sigma 公司；BCL2、BCL2L1、AIB1 和甘油醛 -3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購買于Cell Signalling Technology公司；siRNA合成于上海吉瑪公司；LipofectamineTM3000、細(xì)胞增殖試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測試劑盒、胰蛋白酶消化液購買于Thermo Scientific公司。AIB1過表達(dá)質(zhì)粒由本課題組構(gòu)建。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人卵巢癌細(xì)胞系（SKVO3）購于中科院上海細(xì)胞庫，本試驗(yàn)采用含10%胎牛血清的杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）培養(yǎng)基，將其置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖檢測

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用胰酶消化后稀釋成每毫升5×104個(gè)細(xì)胞的懸液，接種于96孔板中，每孔200 μL（即 10 000個(gè)細(xì)胞），將其放置于 37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后（至少8 h），試驗(yàn)組中加入不同濃度的DDP，對(duì)照組中加入與DDP最大量等體積的DMSO，每組設(shè)8個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h。然后按照CCK-8檢測試劑盒說明書的流程完成細(xì)胞增殖檢測。流程如下：試驗(yàn)中止前4 h，加入 CCK-8 液 20 μL，再培養(yǎng) 4 h，在酶聯(lián)檢測儀上檢測450 nm波長下每孔的吸光度（optical density，OD）值，按下列公式求出細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=（用藥組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%[6]。

1.4 GEPIA分析基因表達(dá)相關(guān)性

通過在線軟件 GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）[8]分析aib1和bcl2、bcl2l1在卵巢癌組織中的相關(guān)性。軟件中Cut-off值選擇50%，分析方法采取Pearson相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 Kaplan-Meier plotter分析基因生存率

通過在線軟件 Kaplan-Meier plotter（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=contact）[9]分 別 分 析aib1基因與卵巢癌患者和順鉑治療后的卵巢癌患者的OS、PPS以及PFS。軟件中Follow up threshold參數(shù)選擇“All”，Restrict analysis to subtypes參數(shù)選擇“All”。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

AIB1的siRNA干擾片段序列中，siRNA-sense（有義鏈）為：5′-GGTCCTAAGGAGTCTCCTGTCTC-3′；anti-sense（無義鏈）為：5′-AAAGACTCCTTAGGACCGTTC-3′。陰性對(duì)照（negative control，NC）si-RNA中，siRNA-sense 為：5′-UCCGUUUCGGUCCACAUUC-3′；anti-sense 為：5′-GAAUGUGGACCGAAACGGA-3′。根據(jù) LipofectamineTM3 000 說明書，轉(zhuǎn)染時(shí)用適量無血清培養(yǎng)液將siRNA（終濃度為100 nmol/L）或AIB1過表達(dá)質(zhì)粒（6孔板中每孔2 μg）與 LipofectamineTM3000混勻，然后加入到細(xì)胞中，8 h后換為含10%胎牛血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并在轉(zhuǎn)染后48 h內(nèi)完成細(xì)胞試驗(yàn)[10]。

1.7 免疫印跡

收集處理過的細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗 3遍，加入適量的裂解液[50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、150 mmol/L Na-Cl、1%Triton X-100、1 mmol/L Na3VO4、100 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）]，在冰上裂解 30 min，12 000 r/min 離心 15 min，收集上清蛋白液。采用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，轉(zhuǎn)膜完成后，用5%奶粉液封閉，之后分別孵育一抗和二抗。A（H2O2）、B（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）液以1∶1的體積比例混合，用濾紙將膜表面液體吸干，然后加ECL（electrochemiluminescence）底物顯色液（即A、B混合液），放入暗盒中并壓片，5 s～5 min 后顯影、定影[9]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，均為獨(dú)立試驗(yàn)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)的比較分析采取t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵巢癌中高aib1基因表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)

為了評(píng)估aib1基因的表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系，本研究通過Kaplan Meier plotter在線軟件，提取了TCGA數(shù)據(jù)庫中卵巢癌患者的aib1基因mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和預(yù)后數(shù)據(jù)，進(jìn)一步進(jìn)行了OS、PFS、PPS分析。OS數(shù)據(jù)完整的患者樣品共1 656例，其中aib1基因高表達(dá)1 104例，低表達(dá)552例。如圖1a所示，aib1基因高表達(dá)組的總生存率顯著低于低表達(dá)組（P=0.000 13）。PFS數(shù)據(jù)完整的患者樣品共1 435例，其中aib1基因高表達(dá)920例，低表達(dá)515例。如圖1b所示，aib1基因高表達(dá)組的無疾病進(jìn)展生存率顯著低于低表達(dá)組（P=5.3×10-5）。PPS數(shù)據(jù)完整的患者樣品數(shù)目最少，共782例，其中aib1基因高表達(dá)202例，低表達(dá)580例。如圖1c所示，aib1基因高表達(dá)組的疾病進(jìn)展后生存率顯著低于低表達(dá)組（P=0.039 00）。

2.2 卵巢癌中高aib1表達(dá)與經(jīng)過順鉑治療的患者預(yù)后相關(guān)

化療藥DDP是臨床一線用于卵巢癌治療最常見的藥。為了評(píng)估aib1基因的表達(dá)是否與順鉑治療卵巢癌患者的療效有關(guān)，本研究通過Kaplan Meier plotter在線軟件提取了TCGA數(shù)據(jù)庫中經(jīng)順鉑治療后的卵巢癌患者的數(shù)據(jù)，分析了其組織中aib1基因mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和預(yù)后數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行了OS、PFS、PPS分析。OS數(shù)據(jù)完整的患者樣品共1 409例，其中aib1基因高表達(dá)943例，低表達(dá)466例。如圖2a所示，aib1基因高表達(dá)組的總生存率顯著低于低表達(dá)組（P=0.006 10）。PFS數(shù)據(jù)完整的患者樣品共1 259例，其中aib1基因高表達(dá)795例，低表達(dá)464例。如圖2b所示，aib1基因高表達(dá)組的無疾病進(jìn)展生存率顯著低于低表達(dá)組（P=4.7×10-6）。最后分析了PPS數(shù)據(jù)完整的患者，共746例，其中aib1基因高表達(dá)195例，低表達(dá)551例。如圖2c所示，aib1基因高表達(dá)組的疾病進(jìn)展后生存率顯著低于低表達(dá)組（P=0.037 00）。

2.3 AIB1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑抵抗

以上試驗(yàn)研究結(jié)果指出，在經(jīng)過化療藥DDP治療的卵巢癌患者中，高表達(dá)aib1的基因患者OS、PPS、PFS都顯著降低，這表明aib1基因可能增強(qiáng)了卵巢癌對(duì)DDP的抵抗。為了直接驗(yàn)證AIB1與卵巢癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性有關(guān)，本研究選擇了SKVO3作為細(xì)胞模型，通過CCK-8試驗(yàn)進(jìn)行順鉑敏感性試驗(yàn)來探討在SKVO3細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)AIB1表達(dá)后DDP對(duì)卵巢癌細(xì)胞活力的影響。如圖3所示，使用濃度為 0、10、20、40、80 μmol/L 的 DDP 處理細(xì)胞24 h和48 h后，完成了CCK-8試驗(yàn)檢測的細(xì)胞活力。在DDP濃度為0 μmol/L時(shí)，即不存在藥物的情況下，干擾了AIB1表達(dá)后，細(xì)胞活力在24 h后減少了5.6%，在48 h后減少了10.1%，表明干擾AIB1表達(dá)能減慢細(xì)胞的增殖。在加了DDP后，隨著DDP濃度的增加，細(xì)胞的活力顯著降低。在加入40 μmol/L的DDP 24 h后，細(xì)胞活力從70%降到了45%，相對(duì)細(xì)胞活力減少了近40%（圖3a、3b），表明干擾AIB1能夠顯著增強(qiáng)DDP對(duì)卵巢癌細(xì)胞活力的抑制。同樣，未經(jīng)過DDP處理的細(xì)胞，即DDP為0 μmol/L時(shí)，過表達(dá)AIB1的SKVO3細(xì)胞在24 h和48 h后細(xì)胞活力均有所增加，但在24h沒有顯著差異（P>0.05），而在48 h后增加了11.6%，表明過表達(dá)AIB1能適當(dāng)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。在加入DDP后，過表達(dá)AIB1能夠顯著抑制DDP對(duì)細(xì)胞活力的抑制。如在加入濃度為80 μmol/L的DDP處理24 h后，細(xì)胞的活力從34%增加到了64%，相對(duì)細(xì)胞活力增加了近1倍。在加入不同濃度的DDP 48 h后，過表達(dá)AIB1的SKVO3細(xì)胞相對(duì)活力同樣顯著增加（圖3c、3d）。上述結(jié)果表明，AIB1增強(qiáng)了卵巢癌細(xì)胞對(duì)DDP的抵抗。

圖1 卵巢癌中高aib1表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)Fig.1 High aib1 expression is associated with poor prognosis in ovarian cancer

圖2 卵巢癌中高aib1表達(dá)與經(jīng)過順鉑治療的患者預(yù)后相關(guān)Fig.2 High aib1 expression is associated with poor prognosis in ovarian cancer with cisplatin treatment

圖3 AIB1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑抵抗Fig.3 AIB1 enhances ovarian cells resistant to cisplatin

2.4 AIB1調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞中BCL2、BCL2XL的表達(dá)

上述結(jié)果表明，AIB1顯著增強(qiáng)了卵巢癌細(xì)胞對(duì)DDP的抵抗。BCL2和BCL2L1是兩個(gè)重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的蛋白。已有報(bào)道表明，BCL2和BCL2L1能促進(jìn)癌細(xì)胞對(duì)DDP的抵抗[11]。為了解AIB1是否調(diào)節(jié)了BCL2和BCL2L1的表達(dá)，本研究在卵巢癌細(xì)胞SKVO3中，通過干擾AIB1的表達(dá)，采用Western blot方法進(jìn)一步檢測了BCL2和BCL2L1的表達(dá)。結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)染AIB1干擾RNA后AIB1的表達(dá)明顯下降，同時(shí)BCL2和BCL2L1的表達(dá)也顯著下降。在SKVO3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了AIB1過表達(dá)質(zhì)粒48 h后，AIB1的表達(dá)明顯上升，同時(shí)BCL2和BCL2L1的表達(dá)也顯著上升。這些結(jié)果表明，AIB1增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)DDP的抵抗與BCL2和BCL2L1有關(guān)。

2.5 卵巢癌組織中bcl2、bcl2l1和 aib1基因表達(dá)顯著相關(guān)

為了繼續(xù)在卵巢癌組織中驗(yàn)證aib1基因與bcl2、bcl2l1基因的表達(dá)相關(guān)。本文通過在線軟件GEPIA分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中的卵巢癌數(shù)據(jù)，通過Pearson相關(guān)分析分析了bcl2、bcl2l1基因和aib1基因mRNA表達(dá)的相關(guān)性。如圖5a所示，bcl2和aib1表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.22，P=2.8×10-6），而由圖 5b 可知，bcl2l1和aib1表達(dá)同樣也具有正相關(guān)性（r=0.38，P=2.8×10-16），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義。這些結(jié)果表明AIB1在卵巢癌細(xì)胞可能正向調(diào)控BCL2和BCL2L1的表達(dá)。

圖4 AIB1調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞中BCL2、BCL2L1的表達(dá)Fig.4 Both BCL2 and BCL2L1 are positively correlated with AIB1 in ovarian cancer

圖5 卵巢癌組織中bcl2、bcl2l1和aib1表達(dá)顯著相關(guān)Fig.5 Both bcl2 and bcl2l1 are positively correlated with aib1 in ovarian cancer

3 討論

近年來，卵巢癌在我國已成為女性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，特別是在城市女性人群中發(fā)病率仍不斷上升，總體表現(xiàn)為發(fā)病年齡趨向于年輕化?；熓锹殉舶┑闹饕委熓侄沃籟12]，其中DDP是臨床上用于卵巢癌治療最常用的化療藥。然而卵巢癌化療療效尚不令人滿意，原因主要為癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性差。順鉑治療中也常發(fā)現(xiàn)患者對(duì)DDP的敏感性較差，并且即使是剛開始對(duì)DDP敏感的患者，在使用一段時(shí)間后便開始產(chǎn)生耐藥[13-14]。目前認(rèn)為，癌細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療藥不敏感的根本原因在于細(xì)胞促凋亡蛋白的低表達(dá)和抑制凋亡蛋白的高表達(dá)[1]。AIB1和很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Wang等[7]的研究表明，AIB1能夠協(xié)助肝受體同源物 1（liver receptor homolog 1，LRH1）轉(zhuǎn)錄激活DNA損傷關(guān)卡蛋白1（mediator of DNA damage checkpoint 1，MDC1）的表達(dá)并增強(qiáng)DNA的損傷修復(fù)能力，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑和阿霉素的耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)，AIB1能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑抵抗，且AIB1上調(diào)了BCL2和BCL2L1的蛋白表達(dá)。BCL2和BCL2L1是控制線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白，這兩個(gè)蛋白的高表達(dá)能夠抑制線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。多數(shù)化療藥的抗癌活性都是通過下調(diào)BCL2和BCL2L1的表達(dá)，從而激活線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[15-16]。比如Zou等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，Aurora-A抑制劑下調(diào)了BCL2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)硫鏈絲菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡也與BCL家族蛋白有關(guān)[18]。此外，DDP誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡也需經(jīng)過線粒體途徑，并且BCL2和BCL2L1的高表達(dá)能夠抑制順鉑誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡[19]。因此可推斷，本研究中AIB1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)DDP的抵抗是通過上調(diào)BCL2和BCL2L1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。另外本研究中所用到的是TCGA數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)庫中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)是基因mRNA的表達(dá)量。aib1基因和bcl2、bcl2l1基因mRNA水平表達(dá)的相關(guān)性表明，AIB1可能是通過轉(zhuǎn)錄上調(diào)了BCL2、BCL2L1的水平促進(jìn)了癌細(xì)胞對(duì)DPP抵抗。這需要進(jìn)一步分析AIB1是否對(duì)BCL2、BCL2L1的啟動(dòng)子區(qū)活性有調(diào)節(jié)，以及是否直接結(jié)合在了這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)上?？傊?，aib1的表達(dá)高低能夠分別反映卵巢癌患者和順鉑治療后的卵巢癌患者的OS，PPS和PFS。這些結(jié)果說明，AIB1可以作為卵巢癌預(yù)后的指標(biāo)以及一個(gè)治療的重要潛在靶點(diǎn)。