黃開偉　李敏敏　史倩倩

摘要：利用稀釋涂布平板法，從受根結(jié)線蟲為害的大蒜根須組織研磨液中篩選對(duì)根結(jié)線蟲有明顯抑殺效果的內(nèi)生生防細(xì)菌。結(jié)果表明，在盆栽試驗(yàn)中，菌株S1-1對(duì)根結(jié)線法的殺線蟲由活性為90.8%。通過盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證生防菌株的防效，菌株S1-1防效為74.86%。結(jié)合菌株形態(tài)特征、分子生物學(xué)和生理生化特性，將菌株S1-1鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。

關(guān)鍵詞：根結(jié)線蟲;生防細(xì)菌;篩選;芽孢桿菌;試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S436? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.02.038

Abstract：The screening and identification of biocontrol bacteria from garlic root against root-knot nematode was performed using dilution methode. The results showed that the nematicidal activity of strain S1-1 against Meloidogyne incognita was 90.8%，and biocontrol effect of strain S1-1 was up to 74.86% against Meloidogyne incognita in pot experiment. Combined its morphlogicul characteristics，morphological characteristics and biochemical characteristics，Strain S1-1 was identified as Bacillus pumilus.

Key words：root-knot nematode;biocontrol bacteria;screening;Bacillus spp.;experiment

根結(jié)線蟲病是如今設(shè)施農(nóng)業(yè)中重要的土傳病害之一，每年在全球范圍內(nèi)造成的損失高達(dá)1 000億美元[1-3]。根結(jié)線蟲寄主范圍十分廣泛，大部分農(nóng)作物都可以成功侵染，嚴(yán)重時(shí)作物減產(chǎn)高達(dá)75%以上。利用稀釋涂布平板法從受根結(jié)線蟲為害的大蒜根須組織研磨液中進(jìn)行根結(jié)線蟲生防細(xì)菌的篩選，并得到一株對(duì)根結(jié)線蟲具有較好防治效果的芽孢桿菌菌株，為根結(jié)線蟲的生物防治提供了資源。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料

1.1.1? ?植物樣品

山東青島采集的受根結(jié)線蟲為害的大蒜樣品。

1.1.2? ?供試線蟲

南方根結(jié)線蟲，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院線蟲實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3? ?LB固體培養(yǎng)基（LBA）培養(yǎng)基配方

胰蛋白胨5 g，酵母抽提物2.5 g，NaCl 5 g，瓊脂粉7.5 g，蒸餾水定容至500 mL，pH值7.0。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ?生防細(xì)菌的分離

稱取受根結(jié)線蟲為害的大蒜根須10 g，用1%的次氯酸鈉消毒5 min，再用無菌水漂洗3遍，放入滅菌研缽中研磨成糊狀，然后用少量無菌水洗入裝有90 mL無菌水的三角瓶中;充分混勻后靜置10 min;吸取100 μL稀釋液均勻涂布在LBA培養(yǎng)基于37 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d;挑取形態(tài)不一樣的單菌落用平板劃線法分離純化，將得到的菌株轉(zhuǎn)接到LBA培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)24 h，于4 ℃下進(jìn)行保存。

1.2.2? ?南方根結(jié)線蟲懸浮液制備

從南方根結(jié)線蟲的空心菜上挑取成熟的線蟲卵塊，用0.5%的次氯酸鈉消毒1 min，無菌水沖洗干凈。將卵塊收集到滅菌培養(yǎng)皿中，加入少量無菌水，于28 ℃下恒溫孵化，48 h后收集孵化的線蟲，備用。

1.2.3? ?生防細(xì)菌的篩選

挑取4 ℃保存于LBA培養(yǎng)基斜面的菌株，于LBA平板上劃線、活化，1 d后挑取單菌落轉(zhuǎn)接到裝有100 mL的LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于37 ℃，200 r/min培養(yǎng)48 h。發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液以轉(zhuǎn)速? 9 000 r/min離心10 min，取上清液備用。取24孔板向其中加入1 mL上清液，對(duì)照組加等量無菌水，挑入大約50條線蟲，于28 ℃下恒溫培養(yǎng)，記錄24 h后線蟲死亡數(shù)，計(jì)算線蟲的校正死亡率。篩選出對(duì)南方根結(jié)線蟲觸殺效果強(qiáng)的生防菌株。

1.2.4? ?生防菌形態(tài)觀察

將對(duì)根結(jié)線蟲直接觸殺效果良好的細(xì)菌在LBA培養(yǎng)基平板上劃線，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌的單菌落形態(tài)，再對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

1.2.5? ?生理生化鑒定

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》8與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》9對(duì)篩選出來的根結(jié)線蟲觸殺效果良好的生防細(xì)菌進(jìn)行伏-普試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)等生理生化鑒定。

1.2.6? ?細(xì)菌DNA的提取及16 SrDNA基因序列分析

利用OmegaBio-Tek試劑盒提取生防芽孢桿菌的DNA;采用16 SrDNA細(xì)菌通用引物27F/1492R進(jìn) 行PCR擴(kuò)增;PCR反應(yīng)體系（25 μL）：10X Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，引物27F/1492R各1 μL，rTaq 0.5 μL，ddH2O 16 μL，模板DNA 2 μL;反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s。63 ℃退火30 s;72 ℃延伸90 s;共35個(gè)循環(huán);72 ℃總延伸7 min;4 ℃保存。PCR擴(kuò)增后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.7? ?根結(jié)線蟲生防細(xì)菌盆栽防效試驗(yàn)

待供試番茄（麗春）長(zhǎng)出第4片真葉后，進(jìn)行細(xì)菌發(fā)酵液的制備，菌體濃度最終調(diào)成1×107/mL。在處理組番茄根部澆20 mL生防菌發(fā)酵液，對(duì)照番茄根部?jī)H澆灌無菌水。3 d后，在番茄根部均勻接種南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（1 000條/株），每個(gè)處理20棵番茄，接種37 d后調(diào)查番茄發(fā)病情況，參考Bridge和Page的方法對(duì)根結(jié)分級(jí)[4]，統(tǒng)計(jì)番茄的根結(jié)數(shù)和病情指數(shù)計(jì)算出防效。

根結(jié)線蟲的根結(jié)分級(jí)判定見表1。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?拮抗線蟲生防細(xì)菌篩選結(jié)果

通過稀釋涂布平板法初步分離出102株細(xì)菌，再通過南方根結(jié)線蟲直接觸殺試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩得到4株對(duì)南方根結(jié)線蟲生防效果較好的細(xì)菌。其中，S1-1菌株于37 ℃，200 r/min培養(yǎng)48 h后其發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲的致死率達(dá)到90.08%。

生防菌發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲的觸殺防效見? 表2。

2.2? ?菌株S1-1的形態(tài)特征

S1-1在LB培養(yǎng)基上菌落顏色為污白色，菌落形狀呈雜草狀散生，在10%的NaCl培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為圓形、邊緣較整齊、表面光滑、菌落不隆起、不透明、培養(yǎng)基顏色未見明顯變化。經(jīng)革蘭氏染色后，菌株形態(tài)為桿狀，呈紫紅色，因此S1-1是革蘭氏陽(yáng)性菌。

2.3? ?菌株S1-1的生理生化特征

芽孢桿菌DR2-1和S1-1的生理生化特性見表3。

2.4? ?菌株S1-1基因序列分析結(jié)果

對(duì)菌株S1-1的16S rDNA基因序列用Blast進(jìn)行序列比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，菌株S1-1與短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）屬同一個(gè)分支，結(jié)合菌株形態(tài)特征和生理生化鑒定結(jié)果，可以鑒定菌株為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。

2.5? ?菌株S1-1對(duì)南方根結(jié)線蟲的防效測(cè)定

通過盆栽試驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)定菌株S1-1對(duì)南方根結(jié)線蟲的防治效果。結(jié)果表明，施用菌株S1-1的發(fā)酵液后，處理組番茄根結(jié)數(shù)目及病情指數(shù)明顯低于對(duì)照組，防治效果達(dá)到74.86%，表明菌株S1-1對(duì)南方根結(jié)線蟲具有良好的防治作用。

南方根結(jié)線蟲盆栽試驗(yàn)見表4。

3? ?結(jié)論

從受根結(jié)線蟲為害的大蒜根須中共分離出4株對(duì)南方根結(jié)線蟲直接觸殺效果較好的生防細(xì)菌。盆栽防效試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株S1-1對(duì)南方根結(jié)線蟲具有良好防效。結(jié)合菌株形態(tài)特征和生理生化鑒定結(jié)果，鑒定該菌株為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。

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