黃 瑩 覃愛平

(1 廣西南寧市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，南寧市 530011,電子郵箱:xiaoyaodu1986@163.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，南寧市 530021)

隨著越來越多的女性推遲生育計(jì)劃，以及我國“二孩政策”的全面開放，我國許多高齡婦女有生育要求?！吨袊啐g不孕女性輔助生殖臨床實(shí)踐指南》[1]將≥35歲定為女性生殖高齡。但在高齡女性行超促排卵治療中，常常出現(xiàn)獲卵數(shù)少、受精異常的情況[2-4]。2011年歐洲人類生殖及胚胎學(xué)會(huì)和美國生殖醫(yī)學(xué)會(huì)制定了卵巢低反應(yīng)(poor ovarian response，POR)的診斷共識(shí)——博洛尼亞共識(shí)，POR的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一是常規(guī)促排卵方案獲卵數(shù)≤3個(gè)[5]。而在2012年由美國生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)和輔助生殖技術(shù)協(xié)會(huì)制定的關(guān)于非男性因素卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射 (intracytoplasmic sperm injection，ICSI)應(yīng)用共識(shí)[6]中，將獲卵數(shù)≤6個(gè)歸到“獲卵數(shù)少”的范疇。

對于卵母細(xì)胞獲得量少的高齡患者，避免胚胎的損失至關(guān)重要，因此，選擇最有效的受精方式來增加胚胎成功活產(chǎn)的概率至關(guān)重要。早在1998年，就有學(xué)者[7]提出，由于ICSI具有高受精率，因此可在高齡低獲卵女性中采用ICSI進(jìn)行授精，即使這些女性并沒有因?yàn)槟行砸蛩囟辉小５獻(xiàn)CSI的受精過程是將精子注射到卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)，規(guī)避了自然的選擇，而且作為一種有創(chuàng)性的操作，可能會(huì)對卵母細(xì)胞造成損傷，所以在高齡、低獲卵、非男性因素不孕的女性中采用ICSI作為授精方式仍存在爭議。本文回顧分析分別行常規(guī)體外受精(invitrofertilization,IVF)和ICSI受精的高齡女性患者的臨床資料，比較兩種方法的受精結(jié)果、胚胎發(fā)育和妊娠情況，探討ICSI能否改善高齡低獲卵患者的助孕結(jié)局，旨在為此類患者選擇科學(xué)合理的授精方式提供參考。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選取2011年1月至2018年12月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診，因輸卵管因素不孕行IVF-胚胎移植(embryo transfer,ET)助孕的150例高齡女性患者，回顧性分析其超促排卵低獲卵周期的資料，按照授精方式分為IVF組101例和ICSI組49例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡40～45歲；(2)采用黃體期長效長方案超促排卵治療；(3)獲卵數(shù)≤5枚；(4)男方體外排精；(5)新鮮胚胎移植(移植D3胚胎)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)男方嚴(yán)重少、弱、畸形精子癥，其中重度少精子癥為3次精液檢查中，兩次精子密度<5×106/mL；重度弱精子癥為3次精液檢查中，兩次前向運(yùn)動(dòng)精子比率<10%；重度畸形精子癥，嚴(yán)格按精子形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，在3次精液檢查中，兩次正常形態(tài)精子<1%,且為原發(fā)不育。(2)部分ICSI(half-ICSI)周期。(3)不明原因的前次IVF完全受精失敗或受精率<30%。(4)多囊卵巢綜合征患者。(5)染色體異常。(6)既往卵巢手術(shù)史、化療及放療史。(7)子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥。(8)宮腔形態(tài)異常、輸卵管積水。

1.2 治療方法 兩組均采用黃體期長效長方案作為控制性超排卵方案。在治療周期的黃體中期(月經(jīng)規(guī)律者：周期第20天或排卵后3～5 d；月經(jīng)不規(guī)則者：口服避孕藥第15天后)，開始應(yīng)用長效促性腺激素釋放激素注射用醋酸曲普瑞林(達(dá)菲林，益普生生物技術(shù)公司，3.75 mg/支)肌肉注射,使用劑量根據(jù)患者體重個(gè)體化決定(1.0～1.5 mg)。促性腺激素(gonadotropins，Gn)啟動(dòng)需要同時(shí)滿足以下幾個(gè)條件：(1)降調(diào)14 d左右。(2)明確垂體已達(dá)到抑制狀態(tài)及無妊娠；當(dāng)日查血性激素促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)<5 IU/L、黃體生成素(luteinizing hormone,LH)<5 IU/L、雌二醇<50 pg/mL，內(nèi)膜厚度≤5 mm。Gn常規(guī)啟動(dòng)劑量根據(jù)患者的年齡、雙側(cè)竇卵泡數(shù)目、基礎(chǔ)FSH水平、體表面積及既往治療周期用藥情況綜合決定。卵巢刺激4～5 d后開始用B超監(jiān)測卵泡發(fā)育和雌二醇水平：當(dāng)卵泡直徑<10 mm，可3～4 d監(jiān)測1次；當(dāng)卵泡直徑10～15 mm，可每2～3 d監(jiān)測1次；當(dāng)優(yōu)勢卵泡>15 mm，可每1～2 d監(jiān)測1次。監(jiān)測子宮內(nèi)膜的厚度、形態(tài)以及子宮肌瘤等病理征象的變化。期間根據(jù)卵泡數(shù)量、生長速度和血中的FSH、LH、雌二醇、孕激素水平調(diào)整Gn用量。當(dāng)2～3個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到18 mm，當(dāng)日抽血查性激素FSH、LH、雌二醇、孕激素水平。使用人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)4 000～10 000 IU或者重組hCG 250 μg進(jìn)行扳機(jī)。一般于注射hCG或重組hCG 34～36 h后取卵。

精液標(biāo)本采用手淫取精，采用上游法處理新鮮精液樣本。卵母細(xì)胞收集后2～6 h內(nèi)完成受精。IVF組：每個(gè)卵周圍放置約2萬～4萬條活動(dòng)精子；ICSI組：將卵丘復(fù)合體去除卵丘細(xì)胞核放射冠，檢查卵子的成熟度，使用MⅡ卵進(jìn)行ICSI操作，精子制動(dòng)后注入卵細(xì)胞，轉(zhuǎn)入受精培養(yǎng)皿中孵育。IVF后16～20 h，觀察受精情況，受精25～27 h后觀察早卵裂情況，72 h后觀察記錄胚胎分裂情況并進(jìn)行評分。取卵后第3天移植D3胚胎。從取卵日開始黃體支持(黃體酮注射液肌內(nèi)注射40～60 mg/d，1次/d)，用至驗(yàn)孕日。移植后第12～14天查血β-hCG，證實(shí)妊娠后繼續(xù)應(yīng)用黃體支持(劑量、用法同上)至胚胎移植后4～6周，行早孕B超。早孕B超證實(shí)宮內(nèi)是否有孕囊、孕囊個(gè)數(shù)、有無胚芽及心管搏動(dòng)，是否為異位妊娠。確定宮內(nèi)妊娠后考慮逐步減量，至妊娠10～12周停止黃體支持。

1.3 胚胎分級標(biāo)準(zhǔn) IVF后25～27 h觀察并記錄早卵裂情況，IVF后72 h觀察并記錄胚胎分裂情況并進(jìn)行評分。參考輔助生殖技術(shù)協(xié)會(huì)的胚胎評分系統(tǒng)[8]進(jìn)行分級：(1)1級，細(xì)胞大小均勻，形態(tài)規(guī)則，透明帶完整，胞質(zhì)均勻清晰，沒有顆?，F(xiàn)象，或/和碎片所占體積小于卵周間隙的5%；(2)2級，細(xì)胞大小略不均勻，形狀略不規(guī)則，胞漿折光性輕微改變，可有顆?，F(xiàn)象，或/和碎片所占體積小于卵周間隙的20%但≥5%；(3)3級，細(xì)胞大小明顯不均勻，明顯的形狀不規(guī)則，可有顆?，F(xiàn)象，或/和碎片所占體積小于卵周間隙的50%但≥20%；(4)4級，細(xì)胞大小嚴(yán)重不均勻，大量碎片，碎片≥卵周間隙的50%，卵漿色黑。第1天觀察到的正常受精[即出現(xiàn)2個(gè)卵原核(2 pronucleus,2PN)]、第3天胚胎的評分達(dá)到1、2級，并且胚胎的卵裂球細(xì)胞數(shù)目≥4個(gè)，評為可移植胚胎；第3天胚胎的評分為1、2級，并且胚胎的卵裂球細(xì)胞數(shù)目≥6個(gè)，評為優(yōu)質(zhì)胚胎。

1.4 觀察指標(biāo) (1)一般資料：女方年齡、男方年齡、女方體質(zhì)指數(shù)、不孕類型、不孕年限。(2)治療相關(guān)臨床資料：基礎(chǔ)FSH、竇卵泡、Gn使用天數(shù)及用量，hCG日血清LH、雌二醇、孕酮，男方精液相關(guān)檢查(取卵日精子濃度、精子前向運(yùn)動(dòng)百分率)，以及獲卵數(shù)、2PN數(shù)、2PN卵裂胚胎數(shù)、可移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)。(3)受精和胚胎情況、妊娠結(jié)局：正常受精率、D3優(yōu)胚率、著床率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率。計(jì)算方法[9]：IVF正常受精率=D1出現(xiàn)2PN卵子數(shù)/IVF加精卵子總數(shù)×100%，ICSI正常受精率=D1出現(xiàn)2PN卵子數(shù)/注射MⅡ卵子總數(shù)×100%；D3優(yōu)胚率=D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù)×100%；著床率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；早期流產(chǎn)率=孕12周內(nèi)自然流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)的分娩數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25,P75)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分?jǐn)?shù))表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者一般資料及治療相關(guān)臨床資料比較 兩組的女方年齡及體質(zhì)指數(shù)、男方年齡、不孕類型、不孕年限差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，治療相關(guān)臨床資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，提示兩組患者具有可比性，見表1～2。

表1 兩組患者一般資料比較

表2 兩組患者治療相關(guān)臨床資料比較

組別n精液濃度(x±s,百萬/mL)精子前向運(yùn)動(dòng)百分率(x±s,%)獲卵數(shù)(x±s,個(gè))2PN數(shù)(x±s,個(gè))2PN卵裂胚胎(x±s,個(gè))可用胚胎數(shù)(x±s,個(gè))優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)[M(P25,P75),個(gè)]移植胚胎數(shù)(x±s,個(gè))IVF組101109.78±50.7548.08±14.153.21±1.372.37±1.172.27±1.162.19±1.101(0,2)1.88±0.73ICSI組49104.99±63.7143.69±15.633.51±1.282.35±1.202.35±1.202.22±1.161(0,2)1.92±0.76 t/z值0.4981.719-1.2930.094-0.391-0.186-0.426-0.290P值0.6190.088 0.1980.925 0.697 0.852 0.670 0.772

2.2 兩組患者受精、胚胎情況和妊娠結(jié)局比較 兩組患者在正常受精率、優(yōu)胚率、著床率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率和活產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表3。

表3 兩組患者受精、胚胎情況和妊娠結(jié)局比較

3 討 論

ICSI選擇已經(jīng)排出第一極體的MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)行操作，但是第一極體排出代表卵母細(xì)胞核已經(jīng)成熟，并不代表細(xì)胞質(zhì)的成熟。細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均成熟的卵母細(xì)胞才有受精能力[10]，所以ICSI選擇的MⅡ期卵母細(xì)胞并不全是細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)都成熟，可能存在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟的不同步。而在常規(guī)IVF中，直到授精后16～18 h才檢查卵母細(xì)胞的成熟度，卵丘細(xì)胞復(fù)合體在培養(yǎng)中保持完整，允許更多的卵母細(xì)胞完成成熟并隨后受精。由此可見，由于人為挑選出來的MⅡ期卵母細(xì)胞可能存在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟的不同步，因此常規(guī)IVF中的卵母細(xì)胞的自然成熟度可能優(yōu)勝于ICSI的MⅡ期卵母細(xì)胞。

近年有大量的回顧性研究比較了常規(guī)IVF和ICSI兩種受精方式對子代出生缺陷和子代發(fā)育、健康狀況的影響，但所得結(jié)論不盡相同，仍存在爭議[11-12]。多數(shù)的觀點(diǎn)認(rèn)為，與常規(guī)IVF相比，因嚴(yán)重男性因素不孕行ICSI助孕夫婦的子代的泌尿生殖系統(tǒng)出生缺陷更高，而因非嚴(yán)重男性因素不孕行ICSI助孕夫婦的子代出生缺陷則無顯著差異[13-19]。目前針對子代發(fā)育、健康狀況的研究還存在不足，因隨訪年限較短，無法精確判斷ICSI安全性。同時(shí)ICSI的醫(yī)療費(fèi)用更高，加重了不孕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，使得不孕患者再進(jìn)行治療的依從性下降。本研究中，常規(guī)IVF組和ICSI組的一般資料及治療相關(guān)臨床資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，說明兩組具有可比性；在此基礎(chǔ)上，兩組的正常受精率、早期流產(chǎn)率、優(yōu)胚率、著床率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，這與既往研究[20-21]結(jié)果相似。說明ICSI與常規(guī)IVF臨床效果相當(dāng)。

胚胎學(xué)家們在進(jìn)行ICSI時(shí)會(huì)選擇形態(tài)正常的活動(dòng)精子，但因?yàn)椴荒艽_定新鮮活動(dòng)精子上有無碎裂或變性的DNA，所以不能避免選到異常精子的風(fēng)險(xiǎn)；此外，ICSI繞過了受精過程的大部分步驟，質(zhì)量差的卵母細(xì)胞可以通過ICSI獲得正常受精，這可能導(dǎo)致臨床妊娠不成功或妊娠后出現(xiàn)早期流產(chǎn)。另一方面，常規(guī)IVF是一個(gè)精卵自由選擇的偏向自然的過程，而ICSI是侵入性的機(jī)械操作，精卵被動(dòng)結(jié)合，如果ICSI操作時(shí)損傷了赤道板，使分裂中期的細(xì)胞受損，或者是一些難以覺察的細(xì)小損傷，它們的發(fā)育潛力都有可能會(huì)迅速下降。這也許可以解釋在本研究中，盡管ICSI組的正常受精率較IVF組稍高，但仍然無法獲得更好的優(yōu)胚率、著床率和活產(chǎn)率的原因。

綜上所述，從有效利用有限的卵母細(xì)胞、改善助孕結(jié)局的出發(fā)點(diǎn)來說，高齡、低獲卵數(shù)、非男性因素不孕的患者應(yīng)用ICSI并不比常規(guī)IVF更具有優(yōu)勢。