張圓　袁婧　高一珊　康貝寧　李增寬　趙勇　閔令江

摘要 采用PCR-RFLP技術(shù)檢測濟寧青山羊PRLR基因部分序列的單核苷酸多態(tài)性，并分析其對濟寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)、出生重的影響，有利于進行分子標(biāo)記輔助選擇從而培育具有高繁殖力的濟寧青山羊。結(jié)果表明，此次引物所擴增的片段具有多態(tài)性，有AA、AB 2種基因型;經(jīng)χ2檢驗，該群體符合哈德-溫伯格平衡。該基因位點對濟寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)沒有顯著效應(yīng)（P>0.05），但是AB基因型產(chǎn)羔數(shù)比AA基因型多0.16只;該基因位點對濟寧青山羊出生重沒有顯著效應(yīng)（P>0.05），但是AB基因型出生重比AA型高0.38 kg。說明此次試驗檢測的PRLR基因的突變位點對濟寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)、出生重等性狀的影響不顯著。

關(guān)鍵詞 濟寧青山羊;PRLR基因;多態(tài)性;PCR-RFLP;經(jīng)濟性狀;關(guān)聯(lián)

中圖分類號 S 827文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）16-0094-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.16.025

Polymorphism of PRLR Gene and Its Association with Major Economic Traits in Jining Grey Goats

ZHANG Yuan1，YUAN Jing2，GAO Yi-shan2 et al （1.Animal Husbandry Development Centre of Jining，Jining，Shandong 272000;2.College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109）

Abstract PCR-RFLP technique was used to detect the single nucleotide polymorphism of some sequences of PRLR gene in Jining grey goats，and its effect on the number of lambsand and birth weight of Jining grey goats were analyzed，which was beneficial to molecular marker-assisted selection and to cultivate Jining grey goats with high fertility.The results showed that the fragment amplified by this primer was polymorphic，and the corresponding genotype were AA and AB.After χ2 test，the group conforms to the Hardy-Weinberg balance.The gene locus had no significant effect on the number of lambs produced in the Jining grey goats（P>0.05），but the genotype AB had 0.16 kids more than genotype AA;the gene locus had no significant effect on the birth weight of Jining grey goats （P>0.05），but the AB genotype birth weight was 0.38 kg higher than AA genotype.The results suggested that the mutation locus of PRLR gene in Jining grey goats in this experiment had no significant effect on the number of lambs，birth weight and other traits in this group.

Key words Jining grey goats;PRLR gene;Polymorphism;PCR-RFLP;Economic traits;Association

基金項目 山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系羊創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-10-08）;濟寧市科技發(fā)展技術(shù)項目“濟寧青山羊高繁殖力相關(guān)基因的篩選和應(yīng)用”。

作者簡介 張圓（1979—），女，山東濟寧人，高級畜牧師，碩士，從事動物遺傳育種與繁殖研究。*通信作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事動物生產(chǎn)與繁育研究。

收稿日期 2020-04-15

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，人們對于羊肉的需求量也日益增加，養(yǎng)羊業(yè)的方向也在發(fā)生轉(zhuǎn)變，逐漸開始由皮用型轉(zhuǎn)向肉用型。濟寧青山羊主要產(chǎn)于山東省西南部的濟寧市和菏澤市，目前已經(jīng)推廣到東北、西北、華南等多個省份以及地區(qū)，其性成熟早、繁殖率高、肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特、適應(yīng)性強，以產(chǎn)花紋獨特的青猾子皮而出名[1]。濟寧青山羊的肉色、大理石花紋、pH、系水力等各項指標(biāo)均比白山羊、波白雜一代表現(xiàn)突出，而且含有較多的礦物質(zhì)元素以及較低的脂肪，其營養(yǎng)價值是普通羊肉的1.8～2.6倍[2]。

山羊的產(chǎn)羔數(shù)是一個重要的經(jīng)濟性狀，受多種因素影響，因此很難用常規(guī)的育種方法在短時間內(nèi)來改良產(chǎn)羔數(shù)，隨著分子生物學(xué)的不斷深入研究，尤其是DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，尋找與產(chǎn)羔數(shù)、出生重等經(jīng)濟性狀相關(guān)的主效基因和遺傳標(biāo)記成為了目前研究的熱點[3]。一些與繁殖活動相關(guān)的激素、蛋白質(zhì)因子以及受體所對應(yīng)的基因均被列為候選基因進行研究，并取得了較大的進展[4]?？紤]到催乳素受體（PRLR）基因在繁殖活動中的綜合作用，國內(nèi)外許多學(xué)者將PRLR 基因作為家畜特別是豬的繁殖性能的一個候選基因進行了大量研究[5]。

催乳素（PRL）是由垂體前葉分泌，控制乳腺發(fā)育、乳汁分泌和乳汁蛋白基因表達的肽激素[6]，可以促黃體維持妊娠，刺激母體做出保護幼崽的行為，促進胚胎著床，直接作用于雄性性腺調(diào)節(jié)睪酮的分泌，與雄性交配行為有關(guān)，影響動物機體免疫系統(tǒng)內(nèi)各種細(xì)胞的增生和分化[5]。研究發(fā)現(xiàn)，催乳素發(fā)揮其生物學(xué)功能的第一步就是通過內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌的作用方式與靶細(xì)胞膜表面的PRLR相結(jié)合，從而引發(fā)各種生理生化反應(yīng)[7]。據(jù)報道，PRLR是由2種不同的機制相互作用控制的，這些機制分別涉及催乳素或卵巢類固醇激素，或以組織特異性的方式組合使用，催乳素受體位點已被選定為候選基因[8]。

國內(nèi)外學(xué)者對羊的PRLR基因與生長、繁殖行為的關(guān)聯(lián)進行了大量的研究，但主要采用的是PCR-SSCP（聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性）技術(shù)。此技術(shù)是利用不同構(gòu)象單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中泳動速率的差異快速有效地檢測出DNA短片段中存在的單核苷酸突變的一項技術(shù)[9]。RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）的基本原理是假如DNA序列中的某個堿基發(fā)生了突變，使突變所在部位的DNA序列產(chǎn)生或失去某種限制性內(nèi)切酶的位點，再利用該限制性內(nèi)切酶消化此DNA便會產(chǎn)生與正常不同的限制性片段，消化后的片段通過凝膠電泳依分子量的大小而分離，并形成連續(xù)的帶譜[10]。PCR-SSCP技術(shù)是先用特定引物擴增基因組DNA，然后用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切擴增產(chǎn)物，電泳檢測多態(tài)性[10]。

該試驗通過PCR-RFLP方法，檢測濟寧青山羊PRLR基因部分序列的單核苷酸多態(tài)性。與PCR-SSCP技術(shù)相比，PCR-RFLP方法簡便、快速、可靠、經(jīng)濟實用，非常適合基層實驗室使用。以濟寧青山羊的子宮為材料，根據(jù)張跟喜等[11]發(fā)布的山羊PRLR 基因外顯子10 和部分3′非翻譯區(qū)的核苷酸序列以及研究結(jié)果（P2引物擴增出來的片段發(fā)生了2處突變即52G→A 和122G→A），利用NEBcutter 2.0軟件，根據(jù)已經(jīng)發(fā)布的PRLR核苷酸序列查找限制酶切位點，在51位點發(fā)現(xiàn)的MspI限制性內(nèi)切酶的酶切位點。該試驗從產(chǎn)羔數(shù)、出生重、子宮體長等多個方面分析其與PRLR基因的關(guān)聯(lián)，對提高山羊產(chǎn)羔數(shù)、出生重的標(biāo)記輔助選擇以及培育高繁殖力的山羊品種具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗儀器。金屬浴，南京沃拓儀器設(shè)備有限公司;高速離心機，eppendorf生命科學(xué)公司;旋渦混勻器，IKA;超微量分光光度計，上海美谷分子儀器有限公司;Quick Drop超微量分光光度計，MOLECuLAR DEVICES;PCR儀，BIORAD;DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠;凝膠成像系統(tǒng)，北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司。

1.1.2 試驗動物。該試驗用到的濟寧青山羊來自山東嘉祥濟寧青山羊原種場，通過查閱系譜檔案材料，選取連續(xù)3胎均產(chǎn)3羔或3羔以上的濟寧青山羊14只，連續(xù)3胎均產(chǎn)單羔的濟寧青山羊12只。該次試驗取的是26只具有產(chǎn)羔數(shù)記載的年齡、體重基本一致，濟寧青山羊的子宮凍存樣品。

1.1.3 試驗試劑。

上游引物、下游引物、DNA抽提試劑盒，購自上海生工生物工程有限公司;2×Phanta Max Master Mix，購自Vazyme科技有限公司;DNA Marker A（25～500）、核酸染料（4s Green Plus Nucleic Acid Stain），購自BBI生命科學(xué)有限公司;限制性內(nèi)切酶Msp Ⅰ、10×NEBuffer，購自neb 公司;瓊脂糖粉、ddH2O、無水乙醇、電泳緩沖液（1×TAE）、上樣緩沖液（10×Loading Buffer）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品DNA提取和濃度測定。試驗方法中的基因組DNA提取和測定等技術(shù)均參照《分子克隆實驗指南》。

1.2.2 引物設(shè)計。

根據(jù)張跟喜等[11]發(fā)表的山羊PRLR 基因外顯子10 及部分3′非翻譯區(qū)的核苷酸序列設(shè)計引物，預(yù)期產(chǎn)物大小為233 bp，引物序列為：上游引物 F：5′-TGTCTGAAAAGTGTGATGAA-3′、下游引物 R：5′-AGCAATGTTGTGGTAAGAATA-3′。

1.2.3 PCR擴增。

1.2.3.1 PCR擴增反應(yīng)體系（20 μL）。mix 10.0 μL，ddH2O 6.4 μL，上下游引物各0.8 μL，模板DNA 2.0 μL。

1.2.3.2 最佳PCR反應(yīng)條件。 95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性30 s，最適退火溫度48 ℃ 15 s共30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3.3 PCR產(chǎn)物檢測。3%瓊脂糖凝膠電泳分析，電壓120 V，電流100 mA，電泳20 s，凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.2.4 DNA的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)。

1.2.4.1 酶切反應(yīng)體系（15 μL）。10×NEBuffer 1.5 μL，限制性內(nèi)切酶MspI 1.0 μL，PCR產(chǎn)物5.0 μL，ddH2O 7.5 μL。

1.2.4.2 酶切產(chǎn)物檢測。3%瓊脂糖凝膠電泳分析，電壓120 V，電流100 mA，電泳20 s，凝膠成像系統(tǒng)成像，判斷基因型。張跟喜等[11]用SSCP法測得部分個體該片段DNA在52位置發(fā)生了基因突變（G→A）。如果從圖片上觀察到2條片段，說明該個體沒有發(fā)生突變，記為 AA基因型;如果從圖片上觀察到3條片段，說明該位點堿基突變，記為AB基因型。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

運用SPSS statistics 23進行最小二乘方差分析，以及不同基因型與濟寧青山羊主要經(jīng)濟性狀相關(guān)性分析，分析不同PRLR基因型與濟寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)、出生重、子宮角長、子宮體長的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 濟寧青山羊子宮DNA的濃度及純度 試驗結(jié)果顯示，樣品的A280/A260值基本都在1.8～2.0，A260/A230值在2.0～2.5，說明該試驗所提取的濟寧青山羊的DNA的濃度和純度基本符合試驗要求，可以進行下一步的PCR擴增試驗。

2.2 濟寧青山羊PRLR基因PCR擴增結(jié)果

配制3%的瓊脂糖凝膠，電泳檢測PCR產(chǎn)物。從圖1可以看出，條帶整齊、明亮，而且片段長度與預(yù)期的相符，擴增效果良好，可以直接進行下一步的限制性內(nèi)切酶試驗。

2.3 PCR-RFLP檢測

配制3%的瓊脂糖凝膠，電泳檢測酶切產(chǎn)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），PCR擴增產(chǎn)物具有多態(tài)性，在這26個樣品當(dāng)中共檢測到AA、AB 2種基因型。

2.4 基因型頻率與基因頻率

在檢測的26只濟寧青山羊中，14只為AA型，12只為AB型，由表1 可知，AA和AB型基因頻率分別為0.538 5、0.461 5，A和B的基因頻率分別為0.769 2、0.230 8。

2.5 PRLR基因的Hardy-Weinberg平衡檢驗

為了判斷該濟寧青山羊群體是否符合Hardy-Weinberg平衡，進行χ2檢驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，χ2=1.21，P>0.05，說明該濟群體符合Hard-Weinberg平衡。

2.6 濟寧青山羊PRLR基因的不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)

從表2可以看出，該基因位點對濟寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)沒有顯著效應(yīng)（P>0.05），但是AB型產(chǎn)羔數(shù)比AA型多0.16只，說明該突變位點對產(chǎn)羔數(shù)沒有影響。

2.7 濟寧青山羊PRLR基因的不同基因型與出生重的關(guān)聯(lián)

由表3可見，該基因位點對濟寧青山羊出生重沒有顯著效應(yīng)（P>0.05），但是AB型出生重比AA型高0.38 kg，說明該突變位點對濟寧青山羊的出生重沒有影響。

2.8 濟寧青山羊PRLR基因的不同基因型與子宮體、子宮角長度的關(guān)聯(lián)

從表4可以看出，AA基因型個體子宮體長、子宮角長比AB基因型個體分別多0.738、0.358 cm，但是最小二乘均值分析結(jié)果表明該突變位點對子宮體、子宮角長度均沒有影響（P>0.05）。

3 討論與結(jié)論

3.1 PRLR基因的多態(tài)性

國內(nèi)外學(xué)者對豬的PRLR基因研究較多，近年來關(guān)于羊的PRLR基因多態(tài)性研究也逐漸增多。Drogemuller等[12]研究不同品種的德國豬與產(chǎn)仔數(shù)有關(guān)的候選基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)催乳素受體基因存在多態(tài)性;牟玉蓮等[13]采用PCR-SSCP技術(shù)檢測催乳素受體基因在4個綿羊群體中的多態(tài)性，結(jié)果表明，有3對引物擴增片段存在多態(tài)性。該試驗所擴增出的濟寧青山羊PRLR基因部分序列，通過PCR-RFLP檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在多態(tài)性;該試驗以濟寧青山羊子宮為材料，采用PCR-RFLP技術(shù)，在該群體中共檢測到AA、AB 2種基因型，但是沒有檢測到BB基因型;通過χ2適合性檢驗，濟寧青山羊群體保持了Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），這可能是由于以下2個原因造成的：一是樣本群體數(shù)量較少;二是人工選擇和長期進化的結(jié)果。

3.2 PRLR基因與產(chǎn)羔數(shù)之間的聯(lián)系

大量研究報道，PRLR基因與繁殖性狀有關(guān)，尤其是與家畜的產(chǎn)仔數(shù)密切相關(guān)。Vincent等[14]研究發(fā)現(xiàn)4個豬品種PRLR基因中存在AluⅠ 的多態(tài)位點，AA 型母豬產(chǎn)仔數(shù)顯著高于AB、BB型。曹果清等[15]利用PCR-SSCP技術(shù)檢測4個品種豬催乳素受體基因第10外顯子的多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRLR基因第10外顯子存在NaeⅠ 多態(tài)位點，而且該位點對母豬產(chǎn)仔性能有顯著影響。汪代華等[16]研究發(fā)現(xiàn)天府肉羊新品群PRLR 基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)密切相關(guān)，AA 型和CC 型2 種純合基因型在控制繁殖性能上具有顯著的遺傳效應(yīng)。該試驗當(dāng)中，PRLR基因不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值分析結(jié)果表明， AB型濟寧青山羊的平均經(jīng)產(chǎn)羔數(shù)比AA型多0.16只，但是二者差異不顯著，這與張跟喜等[11]的研究結(jié)果一致。說明該試驗通過PCR-RFLP技術(shù)檢測到的濟寧青山羊PRLR基因的突變位點對濟寧青山羊遺傳變異的影響較小，而且這個基因位點對該研究群體的產(chǎn)羔數(shù)的影響不顯著。這與目前PRLR基因在繁殖性能方面研究的結(jié)果有一定的差別，出現(xiàn)這種情況的原因可能是：①該試驗樣本含量較少，而且所涉及的品種數(shù)也不多;②該試驗存在一定的抽樣誤差;③該試驗擴增的只是PRLR基因的部分序列，檢測到的突變位點數(shù)量較少。

3.3 PRLR基因與其他性狀之間的聯(lián)系 近年來也出現(xiàn)了一些關(guān)于PRLR基因與家畜體重存在關(guān)聯(lián)的報道。Zhang等[17]研究催乳素受體基因在F1雜交豬 （野豬×大白豬） 中的多態(tài)性，并分析了其與出生重、30 d體重的遺傳相關(guān)性，結(jié)果表明，PRLR基因的AA 基因型與AB和BB相比具有較高的30 d體重 （P<0.05）;Xiong等[18]利用波爾山羊和麻城黑山羊品種，通過DNA測序檢測PRLR基因中的單核苷酸多態(tài)性，分析不同基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)，結(jié)果表明，TT 或TC基因型的個體的出生重明顯低于CC基因型的個體 （P<0.05）。該試驗分析PRLR基因部分序列與濟寧青山羊出生重的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，AB型濟寧青山羊的出生重比AA型高0.38 kg，但是2種基因型之間差異不顯著（P>0.05），說明該位點對濟寧青山羊的出生重沒有影響。子宮是與濟寧青山羊繁殖有關(guān)的器官，子宮的結(jié)構(gòu)與子宮的功能有關(guān)，該試驗分析PRLR基因部分序列與濟寧青山羊子宮角長、子宮體長的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，該位點對濟寧青山羊的子宮體長、子宮角長沒有影響。

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