鄒佳成,諸葛祥雪,習 鶴,李業(yè)新,袁春雪*

(1.同濟大學 材料科學與工程學院，上海 201804；2.西安電子科技大學 先進材料與納米科技學院，陜西 西安 710071；3.濟南大學 化學化工學院，山東 濟南 250022)

pH檢測在化學反應過程控制、環(huán)境分析、食品批量生產、醫(yī)學診斷和生命科學分析中起著重要作用[1-5]。在眾多pH檢測方式中，pH熒光探針由于具有高靈敏度(亞分子水平)、亞納米空間分辨率、高抗干擾能力、操作方便和實時檢測的特性吸引了越來越多的關注[6]。近年來已經報道了眾多pH熒光探針，例如熒光素、香豆素、羅丹明[7-9]和眾多含氮雜環(huán)衍生物[10-11]，然而它們大多具有一定的局限，例如一些探針僅適用于接近中性的pH范圍或因較短的斯托克斯位移而受到嚴重的激發(fā)干擾。因此，設計一種用于檢測酸性pH變化，并具有優(yōu)良性能的pH熒光探針具有較好的實際意義。

朝格爾堿(Tr?ger’s base,TB)由于其具有C2對稱性、手性和剛性凸形的獨特結構，已被應用于諸如分子開關或液晶摻雜劑等廣泛的領域[12-15]。此外，吡啶基團具有高靈敏度和高酸堿質子交換速率[16]，這兩者的獨特性質引發(fā)了我們強烈的興趣。本課題組在前期工作中報道了多種基于TB骨架的熒光探針，它們都展現(xiàn)了出色的pH檢測特性[17-21]。通常，熒光探針的光物理性質可以通過設計不同的末端基團有效地調控；不僅如此，改變取代位點也可以實現(xiàn)對于熒光探針光物理特性的調控，因此進一步探索取代位置效應對熒光探針光物理性質的影響具有重要的意義。對于使用間位取代吡啶端基的熒光探針研究較少，并且氮原子在吡啶上的取代位置對于基于TB的熒光探針光物理性質的影響尚未見報道。

本文設計并合成了含間位取代吡啶端基的熒光探針2,8-雙((E)-2-(吡啶-3-基)乙烯基)-6H,12H-5,11-甲二苯并[b,f] [1,5]重氮(TBMP,Scheme 1)，其結構經1H NMR、13C NMR、HR-MS(ESI)表征。并通過pH滴定實驗和DFT理論計算驗證了其對pH值變化的檢測機理[17-18]。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE 400 MHz型核磁共振儀(TMS為內標)；Agilent 6210 ESI/TOF型高分辨質譜儀；DU-730型紫外-可見光分光光度計；Agilent Cary Eclipse型熒光分光光度計；INESA PHS-2S型臺式pH計。

1,2按文獻[22-23]方法合成；其余所用試劑均為化學純或分析純。

1.2 TBMP的合成

在100 mL三口瓶中加入11.9 g(5.0 mmol)，22.2 mL(20.0 mmol)、碳酸鉀2.8 g(20.0 mmol)、三(2-甲基苯基)磷0.076 g(0.25 mmol)和醋酸鈀0.056 g(0.25 mmol)，通入氮氣，滴加N-甲基吡咯烷酮(NMP)10 mL，于130 ℃反應24 h(TLC檢測)。冷卻至室溫，用二氯甲烷(3×50 mL)萃取，合并有機相，依次用水洗滌，無水硫酸鎂干燥，經硅膠柱層析(洗脫劑：二氯甲烷/乙醇=50/1,V/V)純化得淡黃色粉末TBMP0.84 g,收率39.4%;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:4.18(d,J=16.7 Hz,2H),4.26(s,2H),4.67(d,J=16.7 Hz,2H),7.10(d,J=16.5 Hz,2H),7.15(d,J=8.4 Hz,2H),7.21(s,2H),7.25(d,J=16.5 Hz,2H),7.36(d,J=8.0 Hz,2H),7.41(d,J=9.6 Hz,2H),7.97(d,J=8.0 Hz,2H),8.41(d,J=4.0 Hz,2H),8.69(s,2H);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ:58.21,66.26,123.57,123.81,125.07,125.19,125.54,128.38,130.07,132.02,132.51,132.95,148.07,148.14,148.24;HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C29H24N4{[M+H]+}429.2074,found 429.2078。

1.2 性能測試

將TBMP溶解于DMSO中，配制為10.0 μM儲備液，在測試前稀釋儲備溶液至1.0 mM。實驗中探針TBMP濃度始終為1.0 mM。金屬離子分別由KCl,NaCl,CaCl2,MgCl2,FeCl3,ZnCl2,CuCl2·6H2O,MnCl2,CoCl2·6H2O,Cr(NO3)3·9H2O,Cd(NO3)2·4H2O,Ni(NO3)2·6H2O和AlCl3提供。所有溶液在最終光譜測量前均充分搖勻并靜置30 min。

2 結果與討論

2.1 探針TBMP在不同極性溶劑中的光譜學性質

TBMP在溶液中和固態(tài)下均呈現(xiàn)出強藍色熒光發(fā)射(圖1插圖)。TBMP在不同溶劑中的紫外吸收光譜圖和熒光發(fā)射光譜圖見圖1a和圖1b。由圖可知，TBMP的紫外吸收峰位于331～340 nm附近，隨著溶劑極性的增加，未觀察到明顯的紫外吸收峰偏移；而在熒光光譜中，隨著溶劑極性的增加，熒光峰的位置從384 nm移動至460 nm，顯示出了明顯的紅移，計算得斯托克斯位移從51 nm增加到127 nm。

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λ/nm圖1 TBMP在各溶劑中的紫外吸收光譜(a)和熒光發(fā)射光譜(b)Figure 1 Normalized absorption(a) and fluorescent emission(b) spectra of TBMP in various solvents

TBMP在溶液中和固態(tài)下觀察到的強藍色熒光可能是由于分子內部的D-π-A電荷轉移結構，該結構由TB橋上的胺基作為電子受體(D)以及兩翼上的吡啶端基作為電子供體(A)共同構成，并通過電子的推拉相互作用實現(xiàn)有效的分子內電荷轉移(ICT)。另一方面，TBMP在熒光光譜中明顯的紅移現(xiàn)象可能是由于激發(fā)態(tài)的TBMP分子具有比基態(tài)TBMP分子更高的極性，溶質與溶劑之間更強的偶極-偶極相互作用會導致能級顯著降低，使得TBMP展現(xiàn)出明顯的正溶劑化效應以及顯著的紅移[24]。TBMP在不同極性溶劑中的光譜學性質與對位和鄰位取代的探針TBPP和TBOP相似[17-18]，這表明吡啶中氮原子的取代位置對它們在不同極性溶劑中的光譜性質沒有明顯影響。

λ/nm

λ/nm圖2 TBMP pH滴定實驗的紫外光譜(a)和熒光光譜(b)Figure 2 Absorption(a) and fluorescent emission(b) spectra of TBMP in pH titration experiment

2.2 探針TBMP對pH滴定的紫外和熒光響應

圖2a為pH紫外吸收滴定實驗結果。由圖可知，隨著質子濃度增加(pH 7.09～2.43)，在356 nm處觀察到明顯的消光點，在335 nm的紫外吸收下降并伴隨輕微紅移(335 nm至342 nm)。與TBPP和TBOP(均為50 nm左右)相比[17-18]，TBMP的紅移明顯較小，并且未觀察到新的吸收峰出現(xiàn)，這是由于吡啶上不同取代位置的氮原子與TB骨架之間不同的協(xié)同效應所致[25-26]，推測間位取代的氮原子在質子化之后受到ICT效應的影響較小，對LUMO軌道的影響也較小[27]。

在pH熒光滴定實驗中(圖2b)，TBMP在460 nm處具有明顯的熒光發(fā)射峰，據此可以計算出TBMP具有較大的斯托克斯位移(127 nm)，而較大的斯托克斯位移有助于減少分子內的激發(fā)相互干擾[11,28]。同時，探針TBMP展現(xiàn)出典型的熒光強度與pH值的關系[29](圖3)，隨著pH值降低(7.13～3.11)時，探針TBMP的熒光強度逐漸減弱直到完全猝滅，使得探針TBMP可以用于檢測的pH范圍在 6.5～3.11，根據Henderson-Hasselbach方程可以計算得出TBMP的pKa值為3.89。此外，pH滴定過程中沒有觀察到光譜偏移，表明質子化后的結構(TBMP-H+)在溶液中不發(fā)光。圖4展現(xiàn)了TBMP、TBMP-H+的結構與pH響應機理。

pH圖3 TBMP在460 nm處的熒光強度與pH值的關系;激發(fā)波長335 nmFigure 3 Fluorescence intensities plot of TBMP vs.pH value at 460 nm;λex=335 nm

2.3 pH檢測過程機理探究

為了進一步探索TBMP的檢測機理，在TBMP的DMSO-d6溶液中加入不同濃度的稀鹽酸，并對樣品進行1H NMR檢測，結果見圖4。由圖4可知，隨著質子濃度增加，TB骨架的質子特征吸收峰(10-H和11-H)和吡啶端基上質子特征吸收峰(1-H和2-H)逐漸向低場移動，表明TB骨架上的N和吡啶端基上的N都發(fā)生了質子化。TBMP的質子化位點與只有吡啶端基發(fā)生質子化的TBPP和TBOP有顯著不同[17-18]。

δ圖4 探針TBMP逐滴加入等量稀鹽酸后的1H NMR譜圖Figure 4 1H NMR spectra of probe TBMP in DMSO-d6 by adding equivalent amount of HCl

為了進一步理解TBMP的檢測機理，使用Gaussian 09程序以及B3LYP / 6-311G(d)函數(shù)對TBMP的LUMO和HOMO進行了密度泛函理論(DFT)計算，TBMP-H+的LUMO-HOMO能隙(1.31 eV)小于TBMP的能隙(3.82 eV)，這與紫外吸收光譜中觀察到的紅移現(xiàn)象相對應。對質子化發(fā)生在吡啶端基N1上和質子化發(fā)生在TB骨架N2的結構進行了計算，其相對能量分別為0 eV和3.03 eV，表明TBMP的質子化過程傾向于首先發(fā)生在吡啶端基上的N1。推測從TBMP到TBMP-H+的質子化過程有兩個步驟：首先質子化發(fā)生在吡啶端基的N1，然后TB骨架上的N2被質子化。相比之下，TBPP和TBOP的質子化僅發(fā)生在吡啶端基[17-18]。這是由于TBPP和TBOP的吡啶氮原子的質子化通過ICT效應降低了TB骨架上N周圍的電子密度，使TB骨架上質子化后的結構較不穩(wěn)定，傾向于丟失質子。然而，在TBMP的雙質子化過程中，由于吡啶上間位取代的N具有不同的電子效應和空間位阻效應，兩者的協(xié)同使得ICT效應不會通過共軛體系傳導至TB骨架，因此TB骨架上N質子化后的結構更穩(wěn)定，從而令TBMP展現(xiàn)出獨特的雙質子化過程。

Time/min

Cycies圖5 pH值為6.23和3.94時，探針TBMP在2 h內的熒光強度(460 nm)(a)，反復調節(jié)pH值時探針TBMP熒光強度(460 nm)(b)Figure 5 Plot of fluorescence intensities(460 nm) of TBMP at pH 6.23 and 3.94 in 2 h(a),plot of fluorescence intensities(460 nm) with reverse pH values(b)

2.4 探針TBMP的穩(wěn)定性，可逆性和選擇性

在實際應用中，穩(wěn)定性、可逆性和選擇性是pH熒光探針的關鍵指標。檢測TBMP溶液在pH值 6.23和3.94條件下2 h內的熒光強度(圖5a)，TBMP的熒光強度在整個測試過程中幾乎保持同一水平。這些表明TBMP對于酸性條件的檢測具有優(yōu)秀的穩(wěn)定性。此外，為了檢驗TBMP的可逆性，通過加入微量稀鹽酸和氫氧化鈉將pH值控制在7.00～2.39，反復調節(jié)pH值數(shù)次并記錄熒光強度(圖5b)，其熒光強度仍然保持在相同水平，可以用作酸性pH熒光探針。

與此同時，探究含氮有機小分子新型pH熒光探針的選擇性對于其在實際情況下的應用至關重要，通過測試TBMP的選擇性可以推測出其在不同離子環(huán)境下的抗干擾性(圖6)。由圖可知，金屬離子和氨基酸的存在對熒光強度沒有明顯影響，這表明TBMP在金屬離子和氨基酸出現(xiàn)的情況下對H+的具有優(yōu)秀的選擇性。探針TBMP的穩(wěn)定性、可逆性和選擇性實驗結果與探針TBPP和TBOP相似[17-18]，表明N取代位置效應對探針的穩(wěn)定性、可逆性和選擇性的影響較小。

圖6 在不同金屬離子和氨基酸條件下，探針TBMP在pH 7.00(黑)和pH 3.49(灰)下的熒光強度Figure 6 Fluorescence intensities(460 nm) of TBMP at pH 7.00(black) and 3.49(grey) under the condition with different metal ions and amino acids

設計并合成了基于朝格爾堿骨架和間位取代吡啶端基的新型pH熒光探針TBMP。探針TBMP對于酸性pH變化有明顯的熒光響應并具有較大的斯托克斯位移(127 nm)。1H NMR和DFT理論計算揭示了檢測機理，其中吡啶端基和TB骨架中的氮相繼發(fā)生質子化引起了其對pH值變化的光譜學響應。TBMP在pH滴定實驗中顯示出相對較小的紅移，但它仍具有良好的穩(wěn)定性，靈敏度和選擇性，具有在酸性條件下用作pH熒光探針的潛力。在極性不同的溶液中，TBPP、TBOP和TBMP的光物理性質相似；而在滴定實驗中，受到在吡啶端基上間位取代氮的取代位置效應的影響，TBMP光譜學性質及其質子化過程與另兩種探針有顯著的不同。該研究有助于進一步設計和理解具有吡啶端基的新型熒光探針。