雒向?qū)?王文娟,李 凱,杜宏宏

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科(咸陽712000);2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)生物實驗中心(咸陽712000)

前列腺癌是最常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，多見于60歲以上的老年男性。據(jù)統(tǒng)計，美國男性人群中大約有15%會發(fā)生前列腺癌[1]。近10年以來，我國的前列腺癌發(fā)病率也呈逐年上升趨勢。前列腺癌包括雄激素依賴型(Androgen dependent prostate cancer，ADPC)和雄激素非依賴型(Androgen independent prostate cancer，AIPC)。絕大多數(shù)前列腺癌患者起初為ADPC，即對抑制雄激素的內(nèi)分泌藥物治療敏感有效。然而，經(jīng)抑制雄激素的內(nèi)分泌治療平均2.5年后，上述患者均將轉(zhuǎn)化為AIPC，即對抑制雄激素的內(nèi)分泌治療無反應(yīng)。后者病情進展迅速，生存期一般不超過18個月。因此，AIPC的替代治療藥物研發(fā)成為研究熱點。去甲斑蝥素是從動物類藥物斑蝥蟲體內(nèi)提取斑蝥素的去甲基化類似物?，F(xiàn)有研究顯示，去甲斑蝥素具有強大的抗癌活性，目前已應(yīng)用于多種惡性腫瘤的臨床治療。本次實驗重在研究去甲斑蝥素是否具有抑制AIPC細胞PC-3增殖及誘導(dǎo)其凋亡的作用。

材料與方法

1 實驗材料 PC-3細胞株購自上海細胞所國家細胞庫；去甲斑蝥素購自Aladdin公司，CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自Beyotime公司，細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物公司，熒光倒置顯微鏡(日本，OLYMPUS)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本，SANYO)，酶標儀(美國，Thermo)。

2 實驗方法 ①細胞培養(yǎng)：將解凍復(fù)蘇后的PC-3細胞接種在含有 10% 胎牛血清的完全培養(yǎng)液中，在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，飽和濕度條件下培養(yǎng)。②細胞生長抑制實驗：參照CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒步驟說明，取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的PC-3細胞，用1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度到5×103個/100 μl，接入96孔板，每孔100 μl細胞懸液，同時設(shè)空白對照組，37 ℃培養(yǎng)過夜，加入100 μl不同濃度培養(yǎng)液配制的去甲斑蝥素，使最終濃度為12.5、25.0、50.0 μg/ml，每組3個復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束以后，每孔加入10 μl CCK-8，37 ℃培養(yǎng)4 h，用酶標儀檢測450 nm處吸光度值。③細胞周期和凋亡率測定：按照細胞周期檢測試劑盒說明，取對數(shù)生長期的PC-3細胞，加入不同濃度的含去甲斑蝥素培養(yǎng)液，使去甲斑蝥素最終濃度分別為12.5、25.0、50.0 μg/ml，同時設(shè)立空白對照組，37 ℃分別培養(yǎng)48 h。流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

結(jié) 果

1 去甲斑蝥素對PC-3細胞生長的影響 空白對照組、12.5、25.0、50.0 μg/ml的去甲斑蝥素作用于PC-3細胞，作用48 h后，PC-3細胞受到不同程度地抑制，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。去甲斑蝥素濃度為12.5、25.0、50.0 μg/ml時的抑制率分別為(22.16±4.26)%、(46.71±0.98)%、(52.54 ±3.48)%，隨著去甲斑蝥素藥物濃度的增加，對PC-3細胞的生長抑制效果越加增強，呈現(xiàn)明顯的量-效關(guān)系，與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。IC50為45.87 μg/ml。

2 去甲斑蝥素對PC-3細胞周期的影響 去甲斑蝥素作用PC-3細胞48 h后，可使PC-3細胞的G0/G1期細胞顯著減少，S、G2期PC-3細胞增加，且作用隨著去甲斑蝥素的濃度增加呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，見表1、圖1。

A：空白對照組；B：12.5 μg/ml 去甲斑蝥素組；C：25.0 μg/ml 去甲斑蝥素組；D：50.0 μg/ml 去甲斑蝥素組

表1 不同濃度去甲斑蝥素對PC-3細胞周期的影響

3 去甲斑蝥素對PC-3凋亡率的影響 流式細胞法測定三種去甲斑蝥素濃度劑量作用于PC-3細胞48 h后的凋亡率，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且作用隨著去甲斑蝥素的濃度增加呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，見表2。

表2 不同濃度去甲斑蝥素對PC-3細胞凋亡率的影響

4 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài) 空白對照組、12.5、25.0、50.0 μg/ml去甲斑蝥素組分別作用于PC-3細胞48 h后：空白對照組PC-3細胞活躍生長，呈上皮樣貼壁繁殖，細胞之間緊密連接。各濃度去甲斑蝥素組PC-3細胞體積均變小、變圓，細胞膜完整，細胞間連接疏松，貼壁能力明顯減弱，吹打易離壁漂浮，生長明顯受抑制。且生長抑制率與去甲斑蝥素濃度正相關(guān)。見圖2。

討 論

絕大多數(shù)前列腺癌患者類型起初為雄激素依賴型，即對抑制雄激素的內(nèi)分泌藥物治療敏感有效，因此，雄激素剝脫治療(Androgen deprivation therapy，ADT) 是目前針對ADPC患者重要的治療方法。但經(jīng)過平均2.5年的治療后，上述類型的患者將進展為雄激素非依賴型，即經(jīng)過ADT治療，由于前列腺癌細胞的雄激素受體改變等原因，導(dǎo)致患者對ADT治療失效，進入AIPC階段，出現(xiàn)疾病進展[2]。針對ADT治療失效的前列腺癌患者病理機制的基礎(chǔ)研究顯示，AIPC患者體內(nèi)的前列腺癌組織中，仍存在持續(xù)分泌雄激素的能力，雄激素高水平的持續(xù)表達，可以繼續(xù)活化雄激素受體，刺激患者機體前列腺癌細胞不斷增殖，使得前列腺癌病情惡化蔓延[3-4]。由此可見，阻斷雄激素合成或轉(zhuǎn)化，仍然是治療ADT失效的前列腺癌的關(guān)鍵機制。近年研究發(fā)現(xiàn)的CYP17，是一種阻滯機體合成雄激素的關(guān)鍵限速酶，已經(jīng)證實，CYP17廣泛存在于機體的部分內(nèi)分泌器官(如腎上腺、前列腺和睪丸組織)。而醋酸阿比特龍能夠特異性抑制CYP17的活性，能夠抑制來源于上述內(nèi)分泌器官、尤其是前列腺癌細胞的雄激素合成[5]，屬于新一代的雄激素抑制藥物，能夠有效抑制雄激素在上述組織、特別是前列腺癌組織的生物合成。最新研究結(jié)果顯示，醋酸阿比特龍可以特異性地結(jié)合CYP17酶，且親和度較高，能夠有效地減少相關(guān)內(nèi)分泌組織器官的雄激素分泌。減少自然合成來源的雄激素和前列腺癌組織內(nèi)的雄激素水平，最終達到遏制ADT治療失效的AIPC的疾病進展。然而，基于上述醋酸阿比特龍的特殊藥理機制，患者在服用該藥物后，將不同程度地引起患者促腎上腺皮質(zhì)激素含量的升高，從而容易發(fā)生高血壓、低鉀血癥和水鈉潴留等副作用，嚴重者甚至出現(xiàn)嚴重的肝腎毒性損害[6]。同時，醋酸阿比特龍價格較為昂貴，對患者帶來較大的經(jīng)濟負擔，上述各種因素的存在，限制了阿比特龍的臨床應(yīng)用。

去甲斑蝥素是一種由我國最先成功提取合成的新型抗腫瘤藥物，是由動物類中藥斑蝥蟲體內(nèi)提純的斑蝥素的衍生物(斑蝥素去除1，2位兩個甲基)，能夠發(fā)揮強大的抗癌作用[7]，并且同時具有升高患者外周血白細胞的作用。本實驗首先采用CCK-8法觀察了去甲斑蝥素對人前列腺癌PC-3細胞生長增殖的影響。實驗結(jié)果表明，與空白對照組相比，濃度為12.5、25.0、50.0 μg/ml的去甲斑蝥素作用PC-3細胞48 h，均可顯著抑制人前列腺癌細胞PC-3的細胞生長，且呈濃度依賴性。其IC50值為45.87 μg/ml，說明去甲斑蝥素可濃度依賴地抑制前列腺癌PC-3細胞的生長增殖。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素可使前列腺癌PC-3細胞的G0/G1期細胞顯著減少，S、G2期PC-3細胞增加，且作用隨著去甲斑蝥素的濃度增加呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。流式細胞術(shù)檢測12.5、25.0、50.0 μg/ml濃度的去甲斑蝥素作用PC-3細胞48 h凋亡率，提示去甲斑蝥素可以明顯增加PC-3細胞的凋亡率，且與去甲斑蝥素的作用濃度正相關(guān)。通過倒置顯微鏡觀察不同濃度去甲斑蝥素作用48 h后的PC-3細胞，細胞體積均變小，細胞間連接疏松，貼壁能力明顯減弱，易離壁漂浮，生長明顯受抑制，且生長抑制程度與去甲斑蝥素的干預(yù)濃度正相關(guān)。上述實驗結(jié)果表明去甲斑蝥素能夠抑制PC-3細胞生長，可能的機制是去甲斑蝥素誘導(dǎo)PC-3細胞發(fā)生凋亡并阻滯PC-3細胞的有絲分裂。

根據(jù)現(xiàn)有研究，去甲斑蝥素抗腫瘤作用機制主要包括以下5個方面。①抑制腫瘤細胞增殖：惡性細胞以有絲分裂方式“無限增殖”是產(chǎn)生人體惡性腫瘤細胞的直接原因。多項實驗發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素對人體多種惡性腫瘤細胞的增殖呈現(xiàn)出抑制效果。有國內(nèi)學(xué)者[8]研究去甲斑蝥素對體外培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細胞的抑制作用，結(jié)果表明，去甲斑蝥素能有效抑制MCF-7細胞體外增殖速度，且高濃度、長時間的去甲斑蝥素抑制效果更明顯，存在去甲斑蝥素作用濃度與時間的依賴性。另有學(xué)者觀察到去甲斑蝥素對體外培養(yǎng)肺癌細胞A549呈現(xiàn)顯著的抑制作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)[9]，肺癌A549細胞在去甲斑蝥素作用下，大量細胞阻滯于G2/M期，同時癌細胞內(nèi)的ER-K1/2基因表達明顯降低。②促進腫瘤細胞凋亡：正常的人體細胞，增殖和凋亡是一對同時存在的生命現(xiàn)象，兩者長期處于此消彼長的穩(wěn)定狀態(tài)，而惡性腫瘤細胞的增殖和凋亡則打破了兩者的穩(wěn)定關(guān)系，進入“失衡狀態(tài)”。人體惡性腫瘤細胞發(fā)生的重要原因之一，正是由于凋亡過程在細胞內(nèi)受到某些因素抑制，使細胞不能進入“程序性死亡”，出現(xiàn)惡性無限增殖現(xiàn)象。有學(xué)者[10]采用不同濃度的去甲斑蝥素作用于人肝癌SMMC-7721細胞后，檢測凋亡相關(guān)因子的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素可促進Caspase-3、Bax和細胞色素C的表達，發(fā)揮誘導(dǎo)SMMC-7721細胞凋亡的作用，并且上述三種凋亡相關(guān)因子的表達量與去甲斑蝥素的作用濃度正相關(guān)。實驗研究顯示[11]，不同濃度的去甲斑蝥素處理人胃癌SGC-7901細胞后，抗凋亡蛋白因子表達減少，促凋亡蛋白因子表達則顯著增加，不同濃度去甲斑蝥素均對SGC-7901細胞產(chǎn)生促凋亡作用，使得SGC-7901細胞結(jié)構(gòu)破壞，生長周期停滯在G2/M期，且其促凋亡作用與藥物作用時間及藥物濃度呈相關(guān)性，說明去甲斑蝥素是通過調(diào)控腫瘤細胞各種抗凋亡因子與促凋亡因子的表達來發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作用。③抑制腫瘤細胞DNA復(fù)制：DNA復(fù)制起始蛋白是所有真核細胞啟動DNA復(fù)制必須的調(diào)控因子，包括Cdc-6、Orc、Cdt1和Mcm2-7，其中Cdc-6蛋白屬于癌基因蛋白，可促發(fā)良性細胞向惡性轉(zhuǎn)變。通過抑制Cdc-6的表達，可以產(chǎn)生抗癌作用。實驗研究顯示[12]，在去甲斑蝥素的藥物作用下，人宮頸癌HeLa細胞、人肝癌HepG2細胞、T淋巴瘤Jurkat細胞以及人B淋巴細胞瘤Ramos細胞的DNA復(fù)制起始蛋白Cdc-6均被明顯降解，上述各種惡性細胞的體外生長均受到抑制，并呈現(xiàn)去甲斑蝥素藥物劑量依賴性。說明去甲斑蝥素能夠直接干擾細胞DNA的遺傳復(fù)制，實現(xiàn)抑制腫瘤細胞復(fù)發(fā)和擴散的目的。④干擾腫瘤細胞的細胞周期：有絲分裂也是腫瘤細胞的生長方式。有研究顯示[13]，去甲斑蝥素作用于人卵巢癌SK-OV-3細胞時，可以將癌細胞大量阻滯于有絲分裂的G2/M期，使有絲分裂停滯不前。有學(xué)者[14]采用去甲斑蝥素作用于白血病K562細胞株，發(fā)現(xiàn)去甲斑蝥素可將K562 細胞大量地阻滯于G0/ G1期，抑制有絲分裂進程，同時具有明顯的細胞毒作用。⑤抑制腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移：惡性腫瘤細胞有別于正常細胞和良性腫瘤細胞的主要原因是，前者能夠從原發(fā)部位經(jīng)過血液和淋巴途徑，轉(zhuǎn)移到遠處的正常組織和器官，造成轉(zhuǎn)移播散進展。內(nèi)皮血管生長因子過度表達是刺激腫瘤滋養(yǎng)血管生成的重要因子，基質(zhì)金屬蛋白酶-2是重要的蛋白水解酶，與癌細胞突破外周組織基底膜向遠處侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，已有研究證實[15]，在去甲斑蝥素作用于人膀胱癌T24細胞后，可以下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2和內(nèi)皮血管生長因子的表達，降低膀胱癌的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。還有學(xué)者[16]實驗證實，去甲斑蝥素能夠顯著抑制體外培養(yǎng)的皮膚鱗狀細胞癌A431細胞的體外黏附、侵襲和遷移能力，其機制可能與其能下調(diào)內(nèi)皮血管生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶-2蛋白表達水平相關(guān)。本次實驗發(fā)現(xiàn)去甲斑蝥素能夠誘導(dǎo)人雄激素非依賴型前列腺癌PC-3細胞的凋亡并干擾PC-3細胞的有絲分裂，進而對PC-3細胞增殖產(chǎn)生抑制作用，提示去甲斑蝥素或可成為治療AIPC的有效輔助藥物。去甲斑蝥素影響PC-3細胞周期并誘導(dǎo)其凋亡的詳細病理機制，還有待進一步實驗研究。