王瓊妮，紀(jì)成，尹思琪，胡玉燕，孫豐田，錢暉(江蘇省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

糖尿病腎病是由糖尿病引起的微血管疾病，為糖尿病患者常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥，是終末期腎臟病的主要原因[1]。目前臨床上缺乏早期診斷糖尿病腎病的敏感指標(biāo)，急需尋求新的診斷標(biāo)志物。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類非編碼小RNA分子，長度為20～25個核苷酸，可通過轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在糖尿病腎病進(jìn)展過程中起著重要的作用[3]。miR-146b位于人類染色體10q24.32，能促進(jìn)癌癥發(fā)生并調(diào)節(jié)炎癥及免疫反應(yīng)[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-146b在急性腎損傷中的表達(dá)水平明顯升高，并具有潛在的臨床診斷價值[5]；但對于miR-146b在糖尿病腎病中的研究國內(nèi)尚未見報道。本研究擬探討miR-146b在高糖環(huán)境下對腎細(xì)胞的作用及機(jī)制，以期為糖尿病腎病尋找新的診斷指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1主要儀器及試劑 大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)、大鼠足細(xì)胞(podocyte)及大鼠腎小球系膜細(xì)胞(HBZY-1)購自中國科學(xué)院典藏培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。正常培養(yǎng)基(加入L-DMEM培養(yǎng)基使葡萄糖終濃度為5.5 mmol/L)、高糖培養(yǎng)基(加入L-DMEM培養(yǎng)基使葡萄糖終濃度為30 mmol/L)、Trizol試劑購自美國Gibco公司，胎牛血清(美國Excel公司)，miScript Ⅱ RT Kit、miScript SYBR?Green PCR Kit、miR-146b、U6引物(德國Qiagen公司)，miR-146b模擬物(mimics)、抑制物(inhibitors)及對照序列(NC)購自蘇州吉瑪公司，LipofectamineTM2000(美國Life Technologies公司)，RIPA裂解液(南京諾唯贊生物科技公司)，兔抗鼠YAP單克隆抗體、兔抗鼠p-YAP單克隆抗體、兔抗鼠YAP單克隆抗體(美國CST公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔 IgG二抗(FITC conjugated)、兔抗鼠β-actin單克隆抗體均購自美國SAB公司。CO2培養(yǎng)箱、Nano Drop 1000核酸蛋白測定儀(美國Thermo公司)，高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，ABI 7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，LAS4000化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、Elite激光共聚焦顯微鏡(美國GE公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及高糖誘導(dǎo)的腎細(xì)胞損傷模型構(gòu)建 NRK-52E、podocyte及HBZY-1細(xì)胞均采用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基，于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育，取生長狀況良好細(xì)胞，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化后，將2×105個細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)設(shè)為正常組(置于5.5 mmol/L正常培養(yǎng)基培養(yǎng))及高糖組(置于30 mmol/L高糖培養(yǎng)基培養(yǎng))，每孔加2 mL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3HBZY-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取生長狀態(tài)良好的HBZY-1細(xì)胞，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化后，將1×105個細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)設(shè)為過表達(dá)組：包括miR-146b模擬物mimics組(20 nmol/L miR-146b mimics)及NC組(20 nmol/L mimics陰性對照片段)；敲減組：包括miR-146b抑制劑inhibitors組(100 nmol/L inhibitors)及NC組(100 nmol/L inhibitors陰性對照片段)。過表達(dá)組采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，敲減組采用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞并提取總RNA及蛋白質(zhì)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4RNA提取及qRT-PCR反應(yīng) 采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，Nano Drop 1000核酸蛋白測定儀測定總RNA濃度及純度，取吸光度(A260/280 nm)在1.8～2.0間的RNA樣本，置于-80 ℃保存。按照miScript Ⅱ RT Kit說明書操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20 ℃保存。miR-146b引物(GenBank序列號：NR_030169.1；引物序列：5′-CCUAGGGACU

CAGUUCUGGUG-3′；產(chǎn)物大小為73 bp；退火溫度55 ℃)及U6引物(GenBank序列號：NR_004394.1；引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；產(chǎn)物大小為106 bp；退火溫度55 ℃)，均由德國Qiagen公司采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成。以該cDNA為模板，按照miScript SYBR?Green PCR Kit說明書進(jìn)行qRT-PCR。PCR總反應(yīng)體系為10 μL，包括10×miScript通用引物1 μL，2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，miR-146b/U6引物(10 μmol/L) 1 μL，RNase free H2O 2 μL，3 ng/μL cDNA 1 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，40次循環(huán)。以U6為內(nèi)參，miR-146b的相對表達(dá)水平以2-ΔΔCt法計(jì)算，公式：ΔΔCt=[(樣本Ct目的基因-樣本Ct管家基因)-(對照組Ct目的基因-對照組Ct管家基因)]。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5western blot檢測 取1.3中各組細(xì)胞(1×106個),加入100 μL RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，Nano Drop 1000核酸蛋白測定儀測定蛋白質(zhì)濃度。以3∶1體積比加入4×Loading buffer，煮沸10 min后置于-20 ℃保存。以12%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，每孔蛋白質(zhì)加樣量為150 μg，80 V電泳150 min，350 mA冰浴轉(zhuǎn)膜2 h，50 g/L脫脂奶粉封閉1 h。分別加入兔抗鼠p-YAP單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，兔抗鼠YAP單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，兔抗鼠β-actin單克隆抗體(1∶2 000稀釋)，4 ℃溫育過夜。TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔 IgG二抗(1∶2 000稀釋)，37 ℃溫育1 h，TBST洗膜，HRP化學(xué)發(fā)光底物法進(jìn)行凝膠成像，采用Image J軟件進(jìn)行灰度掃描及結(jié)果判讀，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞免疫熒光 取生長狀況良好的HBZY-1細(xì)胞，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)2×104個細(xì)胞，接種于預(yù)先放置細(xì)胞爬片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，試驗(yàn)設(shè)為正常組、高糖組(試劑同上)，每孔加500 μL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。轉(zhuǎn)染miR-146b的HBZY-1細(xì)胞經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)2×104個細(xì)胞，接種于預(yù)先加入細(xì)胞爬片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，試驗(yàn)設(shè)為miR-146b模擬物mimics及NC組；miR-146b抑制劑inhibitors及NC組，試劑濃度同步驟1.3。培養(yǎng)48 h，PBS洗滌后加入4%多聚甲醛室溫10 min固定。PBS洗滌5 min，重復(fù)3次，0.1% Triton-100破膜20 min。PBS洗滌5 min，重復(fù)3次，5% BSA室溫封閉20 min。加入兔抗鼠YAP單克隆抗體(1∶100稀釋)，4 ℃溫育過夜。PBS洗滌5 min，每次3次，避光加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶500稀釋)，37 ℃溫育45 min。PBS洗滌，Hochest 33342染料(1∶200稀釋)染核5 min，PBS洗滌，使用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，Image J軟件進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度檢測，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1miR-146b在不同處理?xiàng)l件下HBZY-1細(xì)胞中的表達(dá) 與正常組(0.947±0.051)相比，高糖處理后miR-146b在HBZY-1(2.197±0.166)中的表達(dá)水平顯著升高(t=7.215，P<0.01)；而高糖組NRK-52E(0.996±0.056)及podocyte(0.962±0.027)與正常組NRK-52E(1.021±0.020)及podocyte(1.003±0.058)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為0.421和0.639，P均>0.05)。

2.2高糖誘導(dǎo)HBZY-1后YAP蛋白的表達(dá) western blot結(jié)果顯示，與正常組(YAP：0.456±0.004；p-YAP：0.628±0.004)相比，高糖組HBZY-1細(xì)胞中YAP蛋白(0.753±0.008)的表達(dá)水平明顯升高(t=32.17，P<0.001)，而p-YAP蛋白(0.372±0.005)的表達(dá)水平明顯降低(t=39.56，P<0.001)(圖1A)；免疫熒光結(jié)果顯示，與正常組(25.250±3.100)相比，高糖組中YAP蛋白熒光強(qiáng)度(53.620±4.229)明顯升高(t=5.410，P<0.01)，且細(xì)胞核內(nèi)YAP蛋白熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(圖1B)。

2.3HBZY-1過表達(dá)/抑制miR-146b后YAP蛋白的表達(dá) 與mimics NC組(1.009±0.099)相比，mimics組中miR-146b的表達(dá)(7.083±0.283)顯著升高(t=20.24，P<0.001)。與inhibitors NC組(1.006±0.079)相比，inhibitors組中miR-146b的表達(dá)(0.151±0.010)明顯降低(t=10.71，P<0.001)。western blot結(jié)果顯示，正常環(huán)境下過表達(dá)miR-146b后，與mimics NC組(YAP：0.651±0.003；p-YAP：0.917±0.004)相比，mimics組YAP蛋白(0.883±0.005)的表達(dá)明顯升高(t=10.71，P<0.001)，p-YAP(0.606±0.006)的表達(dá)明顯降低(t=44.16，P<0.001)；而在高糖環(huán)境下敲減miR-146b后，與inhibitors NC組(YAP：0.860±0.007；p-YAP：0.638±0.004)相比，inhibitors組YAP(0.706±0.002)的表達(dá)明顯降低(t=22.15，P<0.001)，p-YAP(0.774±0.003)的表達(dá)則明顯升高(t=25.61，P<0.001)(圖2A)。免疫熒光結(jié)果顯示，與mimics NC組(7.880±0.6196)相比，mimics組YAP熒光強(qiáng)度(25.700±1.589)增強(qiáng)(t=10.45，P<0.001)，入核增多；敲減miR-146b后，與inhibitors NC組(26.030±1.074)相比，inhibitors組YAP熒光強(qiáng)度(8.900±1.022)減弱(t=11.56，P<0.001)，入核減少(圖2B)。

3 討論

近年來，有關(guān)miR-146b作用的研究大多集中于腫瘤、炎癥及免疫反應(yīng)方面[4]。例如在甲狀腺乳頭狀癌中miR-146b通過靶向卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域6(CCDC6)促進(jìn)疾病的發(fā)生、發(fā)展[6]，胃癌中miR-146b通過靶向蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡[7]。此外，多項(xiàng)研究表明，miR-146b對于腎臟纖維化疾病具有一定的作用。例如在單側(cè)輸尿管結(jié)扎的腎纖維化模型中miR-146b表達(dá)升高，并可能激活NF-κB參與腎臟纖維化[8]；在由鎘誘發(fā)的腎損傷動物模型中，miR-146b的表達(dá)顯著升高，表明miR-146b可能是腎臟損傷的生物學(xué)標(biāo)志物[9]。在2型糖尿病患者中，miR-146b表達(dá)升高且與糖化血紅蛋白具有一定的關(guān)聯(lián)性[10]；高糖環(huán)境可刺激TNF-α，IL-6和IL-1β等促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，而這些炎癥因子可能是誘導(dǎo)miR-146b表達(dá)升高的原因[11]。本研究結(jié)果顯示，miR-146b在高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞中表達(dá)水平明顯升高，提示高糖環(huán)境下miR-146b可能主要作用于HBZY-1細(xì)胞，影響腎臟皮質(zhì)中腎小球的功能。

YAP轉(zhuǎn)錄共激活因子是Hippo信號通路關(guān)鍵效應(yīng)分子，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和組織穩(wěn)態(tài)[12]。目前研究表明，YAP在糖尿病腎病中具有重要作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)YAP在腎組織中高表達(dá)，并與肌酐、尿素氮、糖尿病腎病分期及病理分級等相關(guān)，提示YAP在2型糖尿病腎病腎損害中起重要作用[13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞中Hippo途徑高度失活，Mst1和Lats1磷酸化的減少促進(jìn)了YAP蛋白的表達(dá)和核易位，從而造成腎小球系膜過度增殖及腎皮質(zhì)損傷[14]。本研究亦證實(shí)了高糖刺激后HBZY-1細(xì)胞的p-YAP蛋白表達(dá)減少，而YAP蛋白表達(dá)升高，且入核增加，YAP入核后則與TEA轉(zhuǎn)錄因子(TEAD)聯(lián)合，介導(dǎo)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成，促進(jìn)腎細(xì)胞損傷；過表達(dá)miR-146b后YAP表達(dá)升高，p-YAP表達(dá)減少，而敲減后則相反，提示miR-146b在HBZY-1細(xì)胞中可能通過Hippo/YAP信號通路發(fā)揮作用。NF2基因是Hippo通路的上游元件，有學(xué)者證實(shí)，miR-146b-3p與NF2基因具有靶向關(guān)系[15]，而miR-146b-3p與miR-146b-5p序列相似，因此，我們推測miR-146b可能通過靶向NF2基因，調(diào)控YAP蛋白的磷酸化情況，進(jìn)而影響Hippo/YAP信號通路的功能。然而，本研究不足之處在于缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時未闡明miR-146b是通過何種機(jī)制調(diào)控Hippo/YAP信號通路，從而影響高糖環(huán)境下HBZY-1的功能。因此，我們將在后續(xù)研究中構(gòu)建糖尿病腎病大鼠模型，結(jié)合臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析miR-146b作為早期診斷標(biāo)志物的可能性，并深入研究miR-146b在糖尿病腎病進(jìn)展過程中可能的生物學(xué)功能及作用機(jī)制，為糖尿病腎病的診斷及治療提供新的治療靶點(diǎn)。