王一軒，張愛(ài)萍，魏琳，錢(qián)志強(qiáng)，李為春(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬泰州市姜堰中醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇泰州 225500)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD) 是一種常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)慢性疾病,其發(fā)病率和死亡率均較高。COPD急性加重(AECOPD)是導(dǎo)致患者反復(fù)住院及肺功能減退的重要原因，感染是其反復(fù)加重的主要因素，且隨病情進(jìn)展，長(zhǎng)期反復(fù)使用抗生素，導(dǎo)致患者感染病原學(xué)種類(lèi)改變，耐藥率增加，故而明確診斷導(dǎo)致感染的病原微生物種類(lèi)在AECOPD治療中具有積極的意義，可以縮短病程，減少肺功能損傷程度，提高生活質(zhì)量。常規(guī)微生物學(xué)檢驗(yàn)方法如微生物培養(yǎng)、尿病原體抗原檢測(cè)等簡(jiǎn)便、普及性高，但受到時(shí)效性、敏感性、標(biāo)本運(yùn)輸處理、分離培養(yǎng)條件等影響，其臨床應(yīng)用具有一定的局限性。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，使得快速定量檢測(cè)AECOPD相關(guān)病原體成為了可能，將二者合理聯(lián)合使用對(duì)改善AECOPD診療及預(yù)后具有重要的臨床意義。

1 AECOPD流行病學(xué)調(diào)查

一項(xiàng)針對(duì)我國(guó)7個(gè)不同地區(qū)共計(jì)20 245名成人的調(diào)查發(fā)現(xiàn)， 40歲以上人群COPD患病率達(dá)8.2%， COPD患者平均每人/每年急性加重0.5～3.5次，AECOPD及其并發(fā)癥是患者醫(yī)療花費(fèi)巨大以及死亡的主要原因[1]。AECOPD對(duì)患者肺功能損害、生活質(zhì)量下降和社會(huì)負(fù)擔(dān)具有嚴(yán)重的負(fù)面影響。AECOPD誘因眾多，上呼吸道感染及空氣污染加重氣道炎癥為主要誘因，進(jìn)而繼發(fā)下呼吸道及肺部的感染，約78%的AECOPD患者可發(fā)現(xiàn)明確的細(xì)菌或病毒感染的證據(jù)，此外，還包括手術(shù)、氣胸、肺栓塞、心力衰竭、心律失常、環(huán)境污染、吸煙、吸入性過(guò)敏原及使用鎮(zhèn)靜藥等誘因[1]。

2 AECOPD 病原學(xué)診斷的臨床價(jià)值

由于AECOPD患者反復(fù)發(fā)生急性加重，且長(zhǎng)期使用抗生素、激素及住院治療，甚至因嚴(yán)重氣流受限和(或)使用機(jī)械通氣，導(dǎo)致多種細(xì)菌感染，并出現(xiàn)抗菌藥物耐藥。研究表明，AECOPD患者痰培養(yǎng)以革蘭陰性菌為主，前3位菌株依次為大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌[2]。革蘭陰性菌對(duì)呼吸黏膜的定植性較強(qiáng)，極易出現(xiàn)耐藥，并易引起呼吸系統(tǒng)感染，同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同肺功能時(shí)期病原菌的分布不同，肺功能越差的患者感染銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、真菌的幾率越高[3-6]。因此，對(duì)于AECOPD患者治療的關(guān)鍵是如何快速找到致病菌，恰當(dāng)合理的應(yīng)用抗生素，使患者得到及時(shí)有效的治療，達(dá)到病情快速控制目標(biāo)，以及縮短病程，減少肺功能損害，改善預(yù)后的目的。

3 AECOPD診斷常用檢測(cè)方法

AECOPD常用的微生物學(xué)檢查方法包括痰涂片、痰及肺泡灌洗液培養(yǎng)、軍團(tuán)菌及肺炎鏈球菌尿抗原檢測(cè)、直接免疫熒光抗體檢測(cè)、非典型病原體血清抗體或核酸篩查等。分子生物學(xué)檢測(cè)法包括：PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time-PCR)、多重PCR、多重real time-PCR、基因芯片技術(shù)、液相芯片(微球體懸浮芯片)技術(shù)、標(biāo)本16S rRNA基因PCR和測(cè)序檢測(cè)技術(shù)等。目前，多重病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)已成為該領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一，多重PCR、多重RT-PCR、基因芯片技術(shù)、液相芯片技術(shù)以及高通量測(cè)序技術(shù)等已成功應(yīng)用于臨床檢測(cè)。因此，快速病原體核酸分子檢測(cè)有望為AECOPD抗感染治療時(shí)抗生素的選擇提供精確指導(dǎo)。

3.1傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè) AECOPD傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)包括痰涂片、痰培養(yǎng)、抗酸染色等，仍是目前臨床上AECOPD病原學(xué)檢驗(yàn)的常規(guī)方法，其具有費(fèi)用少、易普及等優(yōu)勢(shì)，且可作為其他病原學(xué)檢測(cè)方法評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)。目前臨床最易獲得的樣本是來(lái)自患者咳出的痰標(biāo)本，但痰中存在大量定植于上呼吸道的細(xì)菌，因此如何避免標(biāo)本污染對(duì)獲得臨床可信的結(jié)果至關(guān)重要[7]。臨床醫(yī)師應(yīng)囑托患者掌握留取標(biāo)本方法，晨起刷牙漱口后，深咳留取深部痰液，避免口水，減少上呼吸道定植菌污染可能；痰少者可行霧化濃鹽水誘導(dǎo)痰培養(yǎng)，并及時(shí)送檢，如超過(guò)1 h則可能由于細(xì)菌溶解死亡導(dǎo)致檢出率下降。

3.1.1痰涂片 該法為傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)中最經(jīng)典的方法，簡(jiǎn)單、方便、直接，對(duì)臨床診斷及治療具有指導(dǎo)意義。對(duì)采集至呼吸道的分泌物直接涂片，行革蘭染色鏡檢，約半小時(shí)后即可報(bào)告結(jié)果，并能提示所感染的細(xì)菌性質(zhì)為球菌或桿菌，是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或是革蘭氏陰性細(xì)菌。通過(guò)獲得細(xì)菌的形態(tài)學(xué)與染色特點(diǎn)，并結(jié)合臨床癥狀及標(biāo)本采集部位，初步判定是哪類(lèi)細(xì)菌，可為臨床在疾病早期合理用藥提供依據(jù)，也為下一步選用培養(yǎng)基及細(xì)菌鑒定做準(zhǔn)備。通過(guò)有針對(duì)性選用相應(yīng)培養(yǎng)基接種標(biāo)本，可縮短細(xì)菌鑒定時(shí)間，避免盲目選擇培養(yǎng)基。此外，痰涂片標(biāo)本是否合格對(duì)痰培養(yǎng)也有較好的預(yù)測(cè)作用，研究發(fā)現(xiàn)，合格的痰涂片結(jié)果與痰培養(yǎng)結(jié)果符合率約為80%[8]。臨床常用于評(píng)估痰標(biāo)本質(zhì)量的方法是分析鏡下痰細(xì)胞成分的組成比例，一般合格的痰標(biāo)本要求鱗狀上皮細(xì)胞小于10個(gè)/低倍視野，白細(xì)胞大于25個(gè)/低倍視野；或二者比例小于1∶2.5，分離培養(yǎng)前行革蘭氏染色，確定標(biāo)本質(zhì)量。

3.1.2培養(yǎng)法 AECOPD可選擇合格痰培養(yǎng)、誘導(dǎo)痰培養(yǎng)、氣管內(nèi)吸引痰培養(yǎng)、經(jīng)纖維支氣管鏡下采集灌洗液培養(yǎng)、經(jīng)纖維支氣管鏡采用帶套管的防污染毛刷刷檢等；呼吸道常見(jiàn)定植菌的半定量培養(yǎng)對(duì)于判斷培養(yǎng)結(jié)果是否與臨床相關(guān)是有利的，若是培養(yǎng)定量偏低，那么可能缺乏臨床意義。不同類(lèi)型標(biāo)本培養(yǎng)菌落的診斷閾值一般不同：如合格痰分離致病菌培養(yǎng)≥107菌落形成單位(CFU/mL)，支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)≥105CFU/mL，氣管插管內(nèi)吸引物培養(yǎng)≥106CFU/mL[9]，超過(guò)相應(yīng)診斷閾值可能與該種病原菌感染有關(guān)。研究顯示，在發(fā)生肺炎時(shí)可能病原菌的增長(zhǎng)量低于常規(guī)閾值量；尤其在某些特殊病原體感染，數(shù)量不論高低，一旦檢出均認(rèn)為是致病菌，如結(jié)核桿菌、鼠疫耶爾森菌、軍團(tuán)菌等[10]。另外，培養(yǎng)法可進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，從而為臨床針對(duì)性的合理用藥提供依據(jù)。然而培養(yǎng)法操作相對(duì)復(fù)雜，且一些病原菌需要苛刻的培養(yǎng)條件，或使用特殊培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；另有一些病原體培養(yǎng)困難、周期較長(zhǎng)；且下呼吸道標(biāo)本細(xì)菌的種類(lèi)、數(shù)量、部位分布不均，取樣易產(chǎn)生誤差，從而使檢測(cè)陽(yáng)性率偏低；而口咽定植菌的污染也可出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果[11]。此外，由于目前抗生素仍存在濫用情況，而留取痰標(biāo)本前的抗生素使用對(duì)培養(yǎng)檢出率具有較大影響。

3.1.3針對(duì)結(jié)核桿菌的常規(guī)檢測(cè) AECOPD患者由于長(zhǎng)期反復(fù)使用激素及肺組織結(jié)構(gòu)損傷改變，導(dǎo)致結(jié)核桿菌感染率逐年增加，因此，針對(duì)結(jié)核桿菌的檢測(cè)顯得尤為重要，目前主要檢測(cè)手段有痰涂片抗酸染色、結(jié)核抗體試驗(yàn)、熒光PCR、結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)(T-SPOT.TB)，檢測(cè)敏感性分別為11.46%、38.54%、44.80% 和 93.75%，特異性分別為 98.96%、94.64%、82.14%、91.10%，準(zhǔn)確性分別為43.42%、59.21%、58.55%、92.76%，每種方法均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，綜合評(píng)價(jià)結(jié)果表明，T-SPOT.TB 檢測(cè)方法優(yōu)于其他3種檢測(cè)方法[12]。而臨床工作中可將多種檢測(cè)方法聯(lián)合使用，以提高結(jié)核桿菌感染的診斷率。

3.2尿抗原檢測(cè) 主要對(duì)特定病原體如肺炎鏈球菌、軍團(tuán)菌Ⅰ型等相應(yīng)尿抗原檢測(cè)，優(yōu)勢(shì)在于標(biāo)本采集簡(jiǎn)便，診斷敏感性和特異性高，即使在抗菌藥物治療后，病原體仍可被檢出。

3.2.1軍團(tuán)菌尿抗原檢測(cè) 軍團(tuán)菌感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為培養(yǎng)出軍團(tuán)菌，但培養(yǎng)陽(yáng)性偏低，且受前期使用抗生素影響較大。自1979年軍團(tuán)菌抗原從確診的軍團(tuán)菌感染患者尿液中被檢出以來(lái)，軍團(tuán)菌尿抗原檢測(cè)技術(shù)也日益改進(jìn)，目前廣泛使用的檢測(cè)方法為酶免疫檢測(cè)法及免疫層析法。軍團(tuán)菌尿抗原檢測(cè)敏感性達(dá)96%，特異性達(dá)99.9%[13]，且不受先前使用抗生素的影響，可用于軍團(tuán)菌早期感染的快速檢測(cè)。但該法只能檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌血清型Ⅰ型，不能檢測(cè)其他類(lèi)型的嗜肺軍團(tuán)菌及非嗜肺軍團(tuán)菌的感染。此外，由嗜肺軍團(tuán)菌引起的感染約占軍團(tuán)菌總感染的90%，且95%以上為嗜肺軍團(tuán)菌血清型Ⅰ型，因此該法仍有重要的臨床價(jià)值[14]。

3.2.2肺炎鏈球菌尿抗原檢測(cè) 原理是通過(guò)免疫層析法檢測(cè)肺炎鏈球菌莢膜多糖抗原，該抗原為可溶性抗原，可以隨尿液排出，無(wú)論患者血液中是否有嚴(yán)重肺炎鏈球菌感染，均可檢測(cè)。該法簡(jiǎn)便，且敏感性高、特異性好。有學(xué)者證實(shí)，尿肺炎鏈球菌抗原檢測(cè)肺炎鏈球菌感染的敏感性和特異性分別為73.1%和91.9%[15]，但其敏感性與菌株血清型相關(guān)。此外，該法幾乎不影響住院患者抗感染治療方案的制定與選擇[16]。

3.3血清學(xué)抗體檢測(cè)法 該法對(duì)于肺部感染的診斷具有重要意義，尤其在一些特殊情況，例如少痰、無(wú)痰或無(wú)法采集痰培養(yǎng)標(biāo)本的AECOPD患者，以及傳統(tǒng)培養(yǎng)基不易或不能培養(yǎng)的非典型致病菌的感染，采用該法具有明顯的優(yōu)越性。臨床常用方法包括微量凝集法、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、免疫色譜測(cè)定、間接免疫熒光法及酶聯(lián)免疫法等。臨床上已有可檢測(cè)腺病毒、副流感病毒、甲流、乙流、呼吸道合胞病毒、嗜肺軍團(tuán)菌、衣原體、支原體、立克次體等病原體檢測(cè)試劑盒[17]。該試劑盒采集發(fā)生肺部感染時(shí)和感染后2～4周內(nèi)的患者血清，通過(guò)對(duì)比急性期與恢復(fù)期的血清抗體滴度變化進(jìn)行診斷，可用于流行病學(xué)調(diào)查與回顧性研究。然而，血清抗體的檢出可能出現(xiàn)時(shí)間上的延遲，如軍團(tuán)菌血清學(xué)快速檢測(cè)中只有約50%的患者在最初2周內(nèi)檢測(cè)到抗體。因而，此法對(duì)疾病早期診斷及早期用藥的指導(dǎo)價(jià)值存在一定局限性[18]。

3.4質(zhì)譜技術(shù) 該技術(shù)已在臨床應(yīng)用了幾十年，但直到1980年才初步用于細(xì)菌檢測(cè)，此后隨著基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)、電噴霧電離(ESI)等軟電離技術(shù)的出現(xiàn)得到進(jìn)一步發(fā)展，并組成了基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)，從而更適合微生物生物大分子的分析[19]。AECOPD患者可選用痰液或肺泡灌洗液等標(biāo)本進(jìn)行微生物過(guò)夜分離培養(yǎng)后獲得菌落，將其菌落進(jìn)行MALDI-TOF MS分析，每個(gè)樣本分析時(shí)間只需幾秒鐘；與傳統(tǒng)方法相比，該法可實(shí)現(xiàn)對(duì)未知微生物的快速鑒定、分型及毒力檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)便、快速、敏感性和特異性高、易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。然而，該技術(shù)目前還不夠完善，如難以定量，對(duì)細(xì)菌耐藥性及耐藥機(jī)制檢測(cè)的能力有限，無(wú)法鑒定混合菌，對(duì)于報(bào)告的結(jié)果亦缺乏統(tǒng)一的驗(yàn)證和解釋。此外，MALDI-TOF MS對(duì)一些進(jìn)化比較接近、蛋白質(zhì)表達(dá)相似的細(xì)菌辨別較困難，例如無(wú)法將志賀菌、O157型大腸埃希菌與普通大腸埃希菌相鑒別，也不能將肺炎鏈球菌與輕型鏈球菌或口腔鏈球菌區(qū)分開(kāi)。同時(shí)，目前該技術(shù)缺乏不常見(jiàn)微生物相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，且在不同環(huán)境下微生物蛋白質(zhì)表達(dá)不同，豐度亦不同，所以需要對(duì)其程序進(jìn)一步標(biāo)化和再評(píng)價(jià)，以保證感染性疾病診斷中的實(shí)際應(yīng)用。

3.5AECOPD分子診斷技術(shù)

3.5.1第一代測(cè)序技術(shù) 該技術(shù)采用針對(duì)目標(biāo)病原體的特定引物進(jìn)行擴(kuò)增，繼而通過(guò)Sanger測(cè)序獲得序列信息對(duì)微生物進(jìn)行鑒定，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較具有敏感性高，特異性好的特點(diǎn)，因其不受抗菌藥物治療的影響，對(duì)致病菌早期感染的診斷亦具有較高價(jià)值。此法可檢測(cè)痰、鼻咽分泌物、胸水、肺泡灌洗液、肺組織活檢等標(biāo)本。理論上第一代測(cè)序技術(shù)可對(duì)所有呼吸道中存在的菌種進(jìn)行檢測(cè)，尤其對(duì)某些難以培養(yǎng)或需要特殊培養(yǎng)病原體的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)明顯，相較于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，其敏感性及特異性均較高。由于該技術(shù)屬于定性檢測(cè)，一般對(duì)于非正常呼吸道的定植菌，如嗜肺軍團(tuán)菌、結(jié)核桿菌等，若PCR結(jié)果陽(yáng)性且排除污染可能，即可確診為某病原菌感染。然而對(duì)于一些常見(jiàn)呼吸道的定植菌，如卡他莫拉菌、肺炎鏈球菌等，即使PCR結(jié)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，臨床也無(wú)法確定是定植菌或是致病菌感染[20]。因此，該缺陷限制了第一代測(cè)序技術(shù)的臨床普及與運(yùn)用。實(shí)驗(yàn)操作中易出現(xiàn)污染導(dǎo)致結(jié)果假陽(yáng)性，也是其難以推廣的因素。另外，花費(fèi)大，獲得數(shù)據(jù)量少，不能滿足未知樣本測(cè)序的要求，用于含多種不同微生物的復(fù)雜臨床標(biāo)本時(shí)不可靠，這些缺點(diǎn)也影響了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。

3.5.2多重PCR及基因芯片技術(shù) 該技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，在同一個(gè)反應(yīng)體系中，通過(guò)采用多對(duì)特異性引物，對(duì)多種不同的DNA片段同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增。與傳統(tǒng)PCR相比，該法可節(jié)約試劑與樣本用量、降低檢測(cè)成本；同時(shí)節(jié)省勞力、縮短檢測(cè)時(shí)間、提高工作效率。而基因芯片技術(shù)與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，其一份標(biāo)本僅需一次PCR反應(yīng)即可獲得多種病原體信息，具有通量高、速度快、特異性高的優(yōu)勢(shì)[21]。目前已研發(fā)可用于多種呼吸道微生物感染檢測(cè)的基因芯片，包括鏈球菌、百日咳桿菌、肺炎衣原體、肺炎支原體及9種呼吸道感染相關(guān)病毒[22]。其優(yōu)勢(shì)是可針對(duì)常見(jiàn)致病菌快速檢測(cè)，缺點(diǎn)是不能覆蓋其他未制備基因芯片信息的少見(jiàn)致病菌感染，檢測(cè)亦不能精確到耐藥基因檢測(cè)，對(duì)臨床上使用藥物指導(dǎo)有限[23]。

3.5.316S rRNA基因測(cè)序 16S rRNA具有細(xì)菌進(jìn)化上序列保守性和特異性的特點(diǎn)，可作為微生物檢測(cè)、鑒定與分類(lèi)的標(biāo)記基因。目前已有研究采用該技術(shù)進(jìn)行包括COPD急性加重(ECOPD)等多種呼吸道感染性疾病的細(xì)菌鑒定[24]。結(jié)合PCR技術(shù)，16S rRNA測(cè)序可用于估計(jì)呼吸道樣本的微生物負(fù)荷，結(jié)果與傳統(tǒng)的定量培養(yǎng)相一致[25]，亦可用于研究呼吸道微生物菌群的多樣性以及構(gòu)成。過(guò)去認(rèn)為健康人下呼吸道為無(wú)菌環(huán)境，然而隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的證據(jù)表明，人類(lèi)下呼吸道存在微生物定植，且下呼吸道微生物組學(xué)的變化與COPD的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)系[26]。這改變了既往認(rèn)為呼吸道感染僅由單一致病菌引起的認(rèn)知，也對(duì)評(píng)估疾病的進(jìn)展、治療效果及指導(dǎo)合理使用抗生素具有重要意義。雖然與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，16S rRNA測(cè)序可檢測(cè)到更廣的多重病原菌譜，但其應(yīng)用可能會(huì)受到16S rDNA擴(kuò)增過(guò)程中所產(chǎn)生的競(jìng)爭(zhēng)性抑制的影響，從而導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陰性。此外，細(xì)菌DNA提取過(guò)程中，因溶菌酶溶液含有外源性細(xì)菌DNA或操作過(guò)程中的污染也可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果[27]。

3.5.4宏基因二代測(cè)序技術(shù) 該法可直接提取標(biāo)本中所含全部核酸片段并進(jìn)行檢測(cè),經(jīng)生物信息學(xué)分析即可鑒定標(biāo)本中所含核酸序列的種類(lèi), 同時(shí)可獲得病原體序列數(shù)、覆蓋度等定量分析數(shù)據(jù)。使用二代測(cè)序技術(shù)時(shí),標(biāo)本無(wú)須在檢測(cè)前培養(yǎng),避免了難以培養(yǎng)病原微生物的漏檢；可直接非特異性的測(cè)定全部核酸片段序列,無(wú)須預(yù)先選定檢測(cè)范圍，最大程度避免漏檢,并對(duì)患者感染狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估及隨訪[28]。16S rRNA基因測(cè)序雖然是非培養(yǎng)的檢測(cè)手段，但因存在預(yù)先設(shè)計(jì)引物的弊端，難以發(fā)現(xiàn)潛在的病原體，不能全面評(píng)估病原體的組成。隨著宏基因二代測(cè)序技術(shù)的興起，理論上可檢測(cè)出標(biāo)本中所有的病原體，特別是復(fù)雜感染性疾病中少見(jiàn)、不典型或新發(fā)的病原體，敏感性和準(zhǔn)確性高，檢測(cè)時(shí)間短。口腔作為某些下呼吸道感染病原體的定植場(chǎng)所，口腔分泌物吸入與AECOPD等肺部微生物的感染密切相關(guān)?？谇恢锌赡芏ㄖ矃捬蹙?，過(guò)去肺部感染中厭氧菌的培養(yǎng)與鑒定往往被忽視，宏基因二代測(cè)序技術(shù)的使用使得人們對(duì)厭氧菌引起AECOPD等肺部感染有了新的認(rèn)識(shí)[29]。與培養(yǎng)相比，該技術(shù)雖有多種優(yōu)勢(shì)，但也存在一定的局限性，如無(wú)法對(duì)檢出的病原體進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。另一個(gè)局限是檢出結(jié)果難以區(qū)分感染或定植與污染的微生物[30]。此外,檢測(cè)價(jià)格昂貴亦是限制二代測(cè)序技術(shù)推廣的重要因素。

4 小結(jié)及展望

AECOPD長(zhǎng)期反復(fù)使用抗生素、激素及機(jī)械通氣等導(dǎo)致其感染的致病菌與普通社區(qū)獲得性肺炎感染致病菌相差較大，其以肺炎克雷伯、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等革蘭氏陰性桿菌為主，存在少見(jiàn)菌株、混合菌感染甚至真菌感染可能，此類(lèi)病原體生長(zhǎng)速度緩慢以及苛刻的培養(yǎng)條件，導(dǎo)致傳統(tǒng)培養(yǎng)陽(yáng)性率低，造成患者治療時(shí)機(jī)延誤及住院時(shí)間延長(zhǎng)，病死率也大大增加。因此核酸分子診斷作為有效補(bǔ)充，對(duì)常規(guī)檢測(cè)陰性的標(biāo)本具有重要的意義，而宏基因二代測(cè)序技術(shù)較其他核酸檢測(cè)方法具有速度快，敏感性高、特異性高、無(wú)偏性較好、價(jià)格相對(duì)低廉等特點(diǎn)。但是目前二代測(cè)序缺乏公認(rèn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)、耐藥基因難以檢測(cè)以及測(cè)序結(jié)果與治療關(guān)系尚不完全明確，也缺乏與傳統(tǒng)方法之間大規(guī)模的比較驗(yàn)證。隨著技術(shù)的發(fā)展，當(dāng)宏基因二代測(cè)序技術(shù)檢出的病原體基因覆蓋率足夠高時(shí)，可進(jìn)行耐藥基因的檢測(cè)?；谀壳皸l件可通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)迅速獲得AECOPD患者感染的致病菌種，結(jié)合本院既往藥敏，經(jīng)驗(yàn)性選擇抗生素，且能指導(dǎo)培養(yǎng)基選擇，并通過(guò)培養(yǎng)進(jìn)一步證實(shí)并明確藥敏，必要時(shí)可針對(duì)性調(diào)整抗生素，隨著基因測(cè)序發(fā)展，耐藥基因亦能得到檢測(cè)，屆時(shí)其可更好地指導(dǎo)復(fù)雜感染性疾病的抗生素使用，彌補(bǔ)因傳統(tǒng)陽(yáng)性率低，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)導(dǎo)致病情延誤或進(jìn)展，從而達(dá)到縮短病程，減少住院時(shí)間，使COPD患者更早的得到針對(duì)性治療而獲益。此外，隨著第三、第四代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，未來(lái)幾年中采用基因測(cè)序檢測(cè)病原體的成本將大大降低，有助于推動(dòng)其臨床的廣泛應(yīng)用。