林金端,尹衛(wèi)國,劉艷枚,楊夢,禤淑霞,成彬,陳晨,周鵬,劉紅偉(清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院.分子診斷中心，.輸血科，廣東清遠(yuǎn) 511500)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)具有惡性程度高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類健康。早發(fā)現(xiàn)、早治療是提高HCC患者預(yù)后的有效手段。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的具有多種調(diào)控功能的RNA轉(zhuǎn)錄本，參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展調(diào)控，部分lncRNA可在血清中被檢測到，且能穩(wěn)定存在。鑒于血清核酸檢測的簡便性和快速性，血清中特異性表達(dá)的lncRNA有望成為診斷HCC的新一代生物學(xué)標(biāo)志物。泛素結(jié)合酶E2C(UBE2C)假基因3(UBE2CP3)定位于4號染色體。本課題組前期研究時(shí)通過lncRNA表達(dá)譜基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)UBE2CP3在肝癌組織中呈高表達(dá)，后續(xù)研究相繼發(fā)現(xiàn)lncRNA UBE2CP3與肝癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、血管生成密切相關(guān)[1-2]。鑒于EMT、血管生成過程與肝癌生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，本研究擬通過分析HCC患者、HCC轉(zhuǎn)移患者與健康人對照組血清UBE2CP3的表達(dá)水平，探討其潛在的臨床意義。

1 研究對象與方法

1.1研究對象 收集2017年11月至2019年1月于清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院肝膽外科就診的原發(fā)性HCC患者115例，男100例，女15例，年齡27～88歲，中位年齡56歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)美國肝病研究學(xué)會(AASLD)指南[3]，對于直徑>1 cm的結(jié)節(jié),經(jīng)增強(qiáng)CT或MRI之中至少1種影像檢查結(jié)果顯示為“快進(jìn)快出”者，且均經(jīng)病理組織學(xué)明確診斷，術(shù)前未行化療、放療。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除心腎功能異常、其他惡性腫瘤、繼發(fā)性肝癌。其中92例未發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移，23例發(fā)生肝臟內(nèi)多發(fā)性轉(zhuǎn)移或其他部位轉(zhuǎn)移。收集同期在本院體檢中心體檢健康者79例作為健康人對照組，男69例，女10例，年齡22～87歲，中位年齡55歲，肝癌組與健康人對照組年齡(Z=0.32，P=0.75)、性別(χ2=0.006 2，P=0.94)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(No:QPH-IRB-A0115)，患者均知情同意。

1.2儀器與試劑 血清RNA提取試劑盒(廣州美基生物科技公司)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(北京普洛麥格生物技術(shù)公司)，TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物科技公司)。ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，NANO DROP 2000 超微量紫外可見分光光度儀(賽默飛世爾科技公司)。

1.3標(biāo)本采集 使用干燥真空管采集經(jīng)影像學(xué)診斷為肝臟占位HCC患者治療前(體檢健康者于體檢時(shí)采集)的空腹靜脈血2～3 mL，另收集18例接受HCC根治術(shù)的患者術(shù)前以及術(shù)后30 d的空腹靜脈血2～3 mL，2 500 r/min離心5 min，收集血清，置于-20 ℃保存，根據(jù)患者術(shù)后病理診斷結(jié)果及排除標(biāo)準(zhǔn)確定樣本是否入組。

1.4血清總RNA提取 采用柱提法，按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提取血清樣本總RNA，采用NANO DROP 2000 超微量紫外可見分光光度儀檢測RNA純度，取吸光度(A260/280 nm)約為2.0的樣本用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 根據(jù)GenBank中UBE2CP3(基因序列號：100129983)及U6(基因序列號：26827)的序列，由和元生物科技公司設(shè)計(jì)并合成引物。UBE2CP3上游引物序列：5′-AAGTGGTCTGCCCTGTATGATG-3′，下游引物序列：5′-GAGCTATCAATGTTGGGTTTGC-3′；U6上游引物序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。 PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，SYBR premix EXTaq 10 μL，Rox Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，模板DNA 2 μL，無菌ddH2O補(bǔ)足體積至20 μL。反應(yīng)參數(shù):95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。結(jié)果以2-△△Ct法表示。

2 結(jié)果

2.1各組UBE2CP3表達(dá)水平的比較 qRT-PCR檢測結(jié)果表明，血清中UBE2CP3的表達(dá)水平在健康人對照組(12.90±4.96)、HCC未轉(zhuǎn)移組(17.39±3.11)、HCC轉(zhuǎn)移組(22.54±3.96)中呈逐步升高趨勢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=59.23,P<0.01)，進(jìn)一步經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)結(jié)果表明，健康人對照組與HCC未轉(zhuǎn)移組(t=7.23，P<0.01)，健康人對照組與HCC轉(zhuǎn)移組(t=10.12，P<0.01)，HCC未轉(zhuǎn)移組與HCC轉(zhuǎn)移組(t=5.61，P<0.01)間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2ROC曲線分析UBE2CP3診斷HCC的篩查效能 以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，將健康人對照組、HCC組檢測UBE2CP3的相對表達(dá)量納入ROC曲線分析，評估UBE2CP3篩查HCC的效能，結(jié)果顯示ROC曲線面積(AUCROC)為0.794， 95%CI為0.728～0.859，當(dāng)cut-off值為14.035時(shí)，其敏感性為56.96%，特異性為90.35%(圖2)。

2.3手術(shù)前后HCC患者血清UBE2CP3表達(dá)水平的改變 18例HCC患者術(shù)前血清UBE2CP3表達(dá)水平為18.04±2.46，術(shù)后30 d為17.40±2.42，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.934，P<0.01)。

3 討論

HCC是肝臟最常見的腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。研究表明，早期無癥狀小肝癌患者手術(shù)效果好，但HCC患者早期臨床癥狀不明顯，因缺乏有效的早期診斷指標(biāo)，極易錯(cuò)過手術(shù)治療最佳時(shí)機(jī)，其5年生存率較低[4]。因此，尋求可用于HCC診斷和病程監(jiān)測的生物學(xué)標(biāo)志物對提高HCC患者生活質(zhì)量和預(yù)后具有重要的意義。UBE2CP3是本課題組前期通過lncRNA基因芯片差異表達(dá)譜分析時(shí)發(fā)現(xiàn)的在HCC組織中呈高表達(dá)的lncRNA[2]。lncRNA是一類不編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本，廣泛參與基因組轉(zhuǎn)錄前水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平多層次的調(diào)控，影響生物體的多項(xiàng)功能，其表達(dá)水平失衡與多種疾病相關(guān)。大量數(shù)據(jù)表明，lncRNA與HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5-7]；另外，lncRNA也被發(fā)現(xiàn)存在于血液循環(huán)中，血液循環(huán)中l(wèi)ncRNA表達(dá)水平的變化與HCC的病程進(jìn)展有著密切的關(guān)系[8-10]。因此，血清中l(wèi)ncRNA有望成為新一代HCC診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。本研究中，HCC患者血清UBE2CP3的表達(dá)水平明顯高于健康人對照組，且在轉(zhuǎn)移組中呈明顯升高趨勢，提示血清UBE2CP3的表達(dá)水平與HCC轉(zhuǎn)移過程相關(guān)，與我們前期關(guān)于UBE2CP3的功能機(jī)制研究結(jié)果相吻合[1-2]。UBE2CP3與肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移、管腔形成等生物學(xué)功能相關(guān)，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，肝癌細(xì)胞內(nèi)UBE2CP3的表達(dá)水平升高，并釋放入血。因此，血清中UBE2CP3的表達(dá)水平在一定程度上反映了HCC組織UBE2CP3的表達(dá)水平。本研究進(jìn)一步對18例接受HCC根治術(shù)治療的患者術(shù)后30 d血清UBE2CP3表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCC患者接受手術(shù)后其UBE2CP3表達(dá)水平呈下降趨勢，提示血清中的UBE2CP3來源于HCC組織，手術(shù)切除HCC組織后，釋放入血的UBE2CP3減少或消失，而原來血清中存在的UBE2CP3經(jīng)代謝或排泄，從而呈現(xiàn)下降現(xiàn)象。術(shù)后出現(xiàn)UBE2CP3下降并維持較低水平提示手術(shù)效果良好，術(shù)后監(jiān)測血清UBE2CP3的表達(dá)水平可用于HCC根治術(shù)效果和預(yù)后的監(jiān)測。

綜上所述，UBE2CP3參與HCC發(fā)生、發(fā)展過程，血清中UBE2CP3表達(dá)水平與HCC進(jìn)展相關(guān)，后續(xù)研究中我們將進(jìn)行大樣本數(shù)據(jù)驗(yàn)證，UBE2CP3有望成為HCC診斷和療效監(jiān)測的新型生物學(xué)標(biāo)志物。