許超，邱黎霞，張漫，羅雪平，李荊，郭滿盈(中國人民解放軍陸軍第72集團軍醫(yī)院檢驗病理科，浙江湖州 313000)

DNA修復基因——X線修復交叉互補基因3(XRCC3)是單鏈斷裂修復系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)基因；研究表明，在含鉑類化療方案治療的肺癌、結直腸癌、胃癌、宮頸癌等腫瘤患者的病灶組織中XRCC3能夠修復DNA損傷，誘發(fā)鉑類耐藥[1]，故而檢測XRCC3基因多態(tài)性對NSCLC患者化療方案的選擇具有重要的臨床應用價值。腫瘤組織進行DNA分析是目前檢測XRCC3基因多態(tài)性最可靠的方法，但存在標本不易獲取的缺點，限制了其在臨床上的廣泛應用[2]。另有學者通過檢測外周血標本分析XRCC3基因多態(tài)性，但外周血DNA獲取主要源于白細胞，而非腫瘤細胞，影響了其檢測的準確性[3]。循環(huán)腫瘤細胞(CTC)是腫瘤遷移和侵襲的主要機制；腫瘤細胞從病灶處脫落后進入外周血循環(huán)，部分定植于其他臟器，形成轉(zhuǎn)移灶[4]。以CTC為標本的檢測技術在較好地提供腫瘤細胞信息的同時，還便于多次、反復獲取。本研究擬分別在腫瘤組織、外周血及CTC標本中檢測NSCLC患者XRCC3基因多態(tài)性，以期探討CTC能否替代腫瘤組織用于NSCLC患者XRCC3基因多態(tài)性分析。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2018年1月至12月于本院普外科就診的中晚期NSCLC患者84例。其中男64例，女20例，年齡(57.3±8.3)歲；納入標準：(1)經(jīng)病理組織學檢查確診的原發(fā)性NSCLC患者，不伴有其他腫瘤史；(2)無化療、生物療法等抗腫瘤治療史。TNM分期：Ⅲa期20例，Ⅲb期12例，Ⅳ期52例；病理分型：腺癌50例，鱗癌24例，腺磷癌10例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準(批準文號：2018-ZL03)，患者均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 GS-20型負壓抽吸系統(tǒng)(上海硅萊醫(yī)療器械公司)；Light Cycler 480型實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(瑞士Roche公司)；Olympus BX63型自動熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；CelDocEZ型全自動免染凝膠成像分析系統(tǒng)(美國 Bio-Rad公司)。CTC免疫組化鑒定試劑盒(北京中杉生物技術公司)；FITC標記小鼠抗人CD45多克隆抗體(武漢友聯(lián)特生物公司)；DAPI/細胞核染色試劑(上海碧云天生物公司)；EB染色試劑盒(重慶邁凱公司)；人染色體著絲粒特異性探針雜交混合液(上海起發(fā)實驗試劑公司)；Trizol試劑(北京柏萊斯特科技公司)；BstEⅡ限制性內(nèi)切酶(上海連橋生物科技公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集 術中或病理檢查時收集患者肺癌組織標本約2 g用于總RNA抽提，采用Trizol試劑提取組織RNA，變性梯度凝膠電泳檢測RNA的濃度和純度，取濃度>20 ng/μL、純度>2.0的樣本用于后續(xù)試驗，置于-80 ℃保存。此外，收集化療前患者清晨空腹外周靜脈血3 mL，EDTA-K2抗凝，置于4 ℃保存。

1.3.2CTC富集、鑒定與熒光原位雜交 取患者經(jīng)EDTA-K2抗凝的外周靜脈血2 mL，經(jīng)1%多聚甲醛在室溫下預固定10 min，使用負壓抽吸系統(tǒng)過濾外周血，PBS洗滌過濾得到的殘余血液，4%多聚甲醛再次固定，將富集細胞的濾膜37 ℃烘干，根據(jù)CellSearch?標準[CK8/18/19+，含有細胞核的CD45-細胞(DAPI+)[5]]對CTC進行免疫組織化學染色鑒定。使用甲醇和冰乙酸混合液(3∶1)透化處理膜上細胞，加入30 μL人染色體著絲粒特異性探針雜交混合液，與濾膜上的細胞充分接觸，置于雜交儀(76 ℃變性)中37 ℃溫育12 h，次日洗膜除去探針雜交液，20 g/L胎牛血清封閉30 min，滴加5 μL FITC標記小鼠抗人CD45多克隆抗體(1∶500稀釋)，4 ℃避光靜置2 h，加入30 μL DAPI染料，4 ℃靜置2 h。置于Olympus BX63型自動熒光顯微鏡下隨機選取20個視野，計數(shù)CTC(呈亮藍色和橘紅色)的細胞數(shù)目。

1.3.3XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點基因型分析 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)法分析XRCC3基因型。根據(jù)GenBank中XRCC3基因Thr241Met位點(C/T，rs861539)的序列號(AY181026)，由上海捷瑞生物公司采用Oligo7引物設計軟件設計并合成引物。上游引物序列：5′-CCTTGCTCTGTCCCCTCTGT-3′，下游引物序列：5′-AGTCCCCACCCTCTTGTTCA-3′，退火溫度57 ℃，產(chǎn)物片段大小630 bp。PCR反應總體積為30 μL，包括10×PCR Buffer 10 μL、dNTP mix 3 μL、10 μmol/L上、下游引物各1 μL、耐熱DNA聚合酶2 μL、DNA模板1 μL、雙蒸餾水12 μL。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取10 μL擴增產(chǎn)物經(jīng)BstEⅡ限制性內(nèi)切酶37 ℃酶切40 min，用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳并進行EB染色，采用CelDocEZ型全自動免染凝膠成像分析系統(tǒng)檢測并觀察電泳結果，根據(jù)酶切后各片段大小確定XRCC3單核苷酸多態(tài)性和基因型。結果判讀：XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點BstEⅡ限制性內(nèi)切酶酶切后出現(xiàn)481 bp、265 bp、193 bp 3條條帶，其中突變純合型為481 bp，雜合型為481 bp、265 bp、193 bp，野生純合型為265 bp、193 bp。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19. 0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料使用百分比表示，率的比較采用χ2檢驗及Fisher確切概率法；α=0.05為檢驗水準，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點檢測結果 采用PCR-RFLP法可檢出突變純合型、雜合型及野生純合型3種基因型，各基因型分布情況符合遺傳平衡定律(χ2=17.592，P=0.000)。見圖1。

2.2不同臨床病理參數(shù)的NSCLC患者CTC個數(shù)比較 CTC個數(shù)在不同性別、年齡、病理類型及臨床分期的NSCLC患者之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1不同臨床病理參數(shù)的NSCLC患者CTC個數(shù)比較[n(%)]

2.3不同標本XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點多態(tài)性的一致性分析 結果顯示，腫瘤組織、CTC及外周血標本XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點多態(tài)性陽性率之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。以腫瘤組織檢測結果為金標準，CTC檢測XRCC3基因Thr241Met(rs861539)基因型與腫瘤組織基因位點多態(tài)性的一致率為95.24%(80/84)；外周血標本與腫瘤組織基因位點多態(tài)性的一致率為76.19%(64/84)。CTC檢測基因位點多態(tài)性的一致率明顯高于外周血標本，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=16.482，P=0.000)。

表2不同標本XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點多態(tài)性的陽性率比較[n(%)]

2.4XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點多態(tài)性與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關系XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點多態(tài)性在不同年齡、病理類型及TNM分期的NSCLC患者之間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3不同臨床病理參數(shù)NSCLC患者XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點多態(tài)性比較[n(%)]

3 討論

人類XRCC3基因首先從中國倉鼠卵巢細胞突變體系中分離得到，其能夠編碼1個包含346個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，并作為一種關鍵的DNA損傷修復基因，參與DNA單鏈斷裂和堿基損傷的修復[5-7]。相關研究顯示，XRCC3基因多態(tài)性與膀胱癌、食管癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生風險有關[8-10]。亦有研究顯示，XRCC3基因多態(tài)性可影響鉑類、卡鉑、奧沙利鉑等鉑類化療藥物敏感性及治療預后效果[11]。本研究結果顯示，XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點多態(tài)性在不同年齡、病理類型及TNM分期的NSCLC患者之間存在明顯差異，提示XRCC3基因多態(tài)性與NSCLC患者年齡等臨床病理參數(shù)明顯相關。另有研究顯示，XRCC3基因rs861534和rs8615302位點的多態(tài)性與乳腺癌的內(nèi)分泌治療風險和轉(zhuǎn)移復發(fā)風險密切相關[11-13]；XRCC3基因Thr241Met多態(tài)性可能參與胃癌易感性[14]。結合本研究結果推測，XRCC3基因多態(tài)性在與NSCLC患者年齡等臨床病理參數(shù)呈明顯相關的同時，還可能與肺癌易感性、化療耐藥性等存在關聯(lián)，但需進一步深入研究。

由于NSCLC患者外周血易于采集，創(chuàng)傷小，DNA提取難度較低，因此目前相關研究多集中于檢測外周血XRCC3基因型[15]；但由于DNA主要來自于外周血中的白細胞，對檢測準確性造成了不良影響[16]。CTC指進入人體外周血的腫瘤細胞，主要來源于原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤病灶組織，基因組構成與腫瘤組織具有高度一致性[11]。目前研究認為，以腫瘤組織為標本檢測得到的XRCC3基因多態(tài)性準確性最高，但獲得難度較高[17]；因此，探究CTC檢測腫瘤相關基因突變是否能夠替代腫瘤組織具有重要意義。本研究以腫瘤組織檢測的XRCC3基因多態(tài)性為金標準，并與CTC和外周血檢測的XRCC3基因多態(tài)性進行比較分析，結果顯示，腫瘤組織、CTC及外周血檢測XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點多態(tài)性的陽性率之間差異無統(tǒng)計學意義；我們進一步以腫瘤組織檢測的XRCC3基因多態(tài)性為金標準，并比較CTC與外周血檢測結果的一致率，結果發(fā)現(xiàn)CTC檢測XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點多態(tài)性的一致性高達95.24%，明顯高于外周血標本的76.19%,提示CTC能夠較好地反映出肺癌組織基因型。目前臨床上還可直接從外周血中分離和富集CTC，準確性高，無需通過手術獲取腫瘤組織標本。但亦有研究顯示，由于目前的CTC捕捉技術無法保證百分百的純度，臨床應用中需對捕獲的細胞進行鑒定，以確定為CTC細胞，進而減少檢測的假陽性率和假陰性率[18]；此外，在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中，CTC的數(shù)目呈動態(tài)變化的同時，其攜帶的分子標志物也在不斷變化[19]。因此，臨床應用CTC檢測NSCLC患者基因型時應綜合考慮以上因素，提高檢測的準確性。雖然本研究納入的患者均無化療、生物療法等抗腫瘤治療史，避免了化療等因素對XRCC3基因型的影響，但因此所納入的樣本量偏少，在今后的研究中應進一步擴大樣本量進行深入研究。