金克霞， 江澤慧， 馬建鋒， 田根林， 楊淑敏， 尚莉莉， 馮 龍， 劉杏娥

國際竹藤中心， 竹藤科學與技術重點實驗室， 北京 100102

引 言

酸性亞氯酸鈉法是目前實驗室最常用的木質素脫除方法， 在脫木質素過程中可最大程度地保留綜纖維素不被脫除[1]。 研究表明木質素脫除是一個極其復雜的反應過程， 不僅受到細胞壁中木質素-碳水化合物復合體聯(lián)結類型的影響， 而且木質素大分子間不同化學鍵合類型， 對試劑的反應程度也不一樣[2-4]。 因此， 不同的木質纖維素原料脫木素的動力學表現(xiàn)也存在著差異[5]。 然而， 學者們在用亞氯酸鈉法脫木素時， 其處理時間常常以經(jīng)驗性為主， 常用的表征殘余木質素含量的方法， 如離子色譜、 紅外光譜、 核磁共振等， 不僅制樣繁瑣、 耗時， 且反映的信息是植物細胞壁的總體平均結果， 關于脫木質素過程中木質素含量在不同細胞及形態(tài)學區(qū)域的動態(tài)變化方面的有效信息相對較少。

拉曼光譜及顯微成像具有快速、 簡單、 無損、 可重復檢測的特點， 同時具有較高的空間和光譜分辨率， 已廣泛應用于分子化學結構研究和化學組成分析[6]。 此外， 木質素三種基本結構單元， 即愈瘡木基(G)、 紫丁香基(S)和對羥苯基在拉曼光譜中均有特定的特征峰[7]。 因此， 本文擬采用拉曼光譜及顯微成像技術， 以闊葉木(桉木)、 針葉木(杉木)、 禾本科(毛竹)中最常見的樹種為例， 定性和半定量地測定亞氯酸鈉法脫木素過程中殘余木質素及單體含量在不同細胞及形態(tài)學區(qū)域的動態(tài)變化， 以加深對亞氯酸鈉法脫木素的動力學及選擇性的理解。

1 實驗部分

1.1 原料

桉木(Eucalyptusurophylla)， 高15.6 m， 直徑16.5 cm， 采自北京林業(yè)大學林場； 杉木(Cunninghamialanceolate(Lamb.) Hook．)， 高8.4 m， 直徑11.3 cm， 采自浙江省麗水市白云山森林保護區(qū)； 毛竹(Phyllostachyspubescens)， 三年生， 采自國際竹藤中心安徽黃山太平實驗中心林場。 三種木材均取胸徑材， 然后利用單面刀片將樣品分割成長×寬×高大小為0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm左右的矩形樣品塊， 并用滑走式切片機(Leica RM 2010R)在橫截面切取15 μm厚的切片。

1.2 酸性亞氯酸鈉處理

將每組切片浸漬在酸性亞氯酸鹽溶液中， 密封， 并置于75 ℃的水浴鍋中， 處理時間根據(jù)不同切片中木質素的實際脫除情況決定(0～1.5 h)。 酸性亞氯酸鈉鹽溶液的具體配制為： 固液比為1∶26， 亞氯酸鈉和冰醋酸的濃度分別0.3 g·g-1， 0.1 mL·g-1。 反應結束后， 加入大量去離子水終止反應， 小心取出切片， 并用去離子水反復沖洗至中性， 獲得的樣品用于拉曼顯微鏡檢測。

1.3 共聚焦拉曼顯微光譜檢測

每組亞氯酸鹽處理后的切片依次置于載玻片上， 封好片后采用顯微共聚焦拉曼光譜(HR Evolution, Horiba Jobin Yvon)進行光譜采集和成像。 為獲得較高的空間分辨率， 光譜采集時采用100倍油鏡(MPlan100×， Oil， NA=1.25)以及532 nm激發(fā)波長， 激光功率為8 mW。 測試時光柵為300 mm-1， 狹縫寬度為100 μm， 掃描步距0.5 μm， 單點光譜采集時間1 s， 光譜測定范圍500～3 100 cm-1， 光譜分辨率2 cm-1， 最后利用LabSpec6軟件對獲得數(shù)據(jù)進行后期處理， 包括宇宙射線移除和光譜基線校正。

2 結果與討論

2.1 木質素的拉曼特征峰

圖1為未處理的桉木、 杉木、 毛竹纖維細胞次生壁的平均拉曼光譜， 不同樹種在1 270， 1 331和1 598 cm-1位置均有特征峰。 其中， 1 598 cm-1歸屬于木質素芳香族骨架振動， 1 270 cm-1歸屬于G型木質素芳香環(huán)醚鍵伸縮振動， 1 331 cm-1為S型木質素酚羥基彎曲振動[7]。 特別的， 不同于木材， 禾本科毛竹纖維細胞在1 171 cm-1處有獨特的拉曼特征峰， 歸屬于羥基肉桂酸(HCA)中肉桂酰酯鍵， 與木質素和半纖維素以酯鍵和醚鍵連接， 進而形成木質素-酚酸-碳水化合物復合體存在于禾本科植物細胞壁中[8]。

2.2 亞氯酸鈉法脫木素的選擇性

通過對木質素特征峰(1 540～1 700 cm-1)區(qū)域進行積分， 發(fā)現(xiàn)在未處理桉木中， 導管次生壁(V-S)、 木射線次生壁(R-S)及纖維細胞的細胞角隅(CC)和復合胞間層(CML)均含有較高含量的木質素， 而纖維細胞次生壁(F-S)中木質素含量相對較低[圖2(a)]。 經(jīng)亞氯酸鈉溶液處理0.5 h后， 木質素含量在各細胞類型中均顯著下降， 尤其是纖維細胞的CC和CML區(qū)域； 值得注意的是， V-S和R-S中木質素含量依然要高于F-S。 隨著處理時間的延長(1.0～1.5 h)， 木質素含量的分布變得更均勻， 各細胞濃度均變得很低。 在逐步脫除木質素過程中， V-S和R-S展現(xiàn)出更高的殘留木質素濃度[圖2(b—d)]， 其中V-S木質素強度最高， R-S強度次之， F-S最低， 說明導管細胞中木質素最難被降解， 而纖維細胞中木質素最容易被移除。 類似的， 針葉材杉木在逐步脫木質素過程中， 射線細胞剩余木質素的濃度也略高于纖維細胞(即管胞)， 進一步證明在組織水平上纖維細胞中木質素是最容易被降解的[圖2(e—h)]。

圖1 桉木、 杉木、 毛竹纖維細胞的平均拉曼光譜

為了進一步探索脫木質素過程中殘余木質素濃度的動態(tài)變化， 我們分別提取出不同樹種、 不同細胞中木質素在1 598， 1 270(G型)和1 331 cm-1(S型)位置的平均拉曼光譜強度變化(圖3， 圖4)。 在脫木素過程中， 發(fā)現(xiàn)S型木質素的拉曼強度降低比G型木質素更顯著， 說明S型木質素在酸性亞氯酸鈉溶液中更容易被脫除。 類似的， 在酸處理和堿處理中， 也發(fā)現(xiàn)S型木質素更容易被脫除[2, 9]。 這主要是因為S型木質素含有大量的β-β鍵， 其分子量更低， 有利于促進木質素在細胞壁間的移動和脫除[10]。 此外， S型木質素與碳水化合物間的交聯(lián)比G型木質素少， 結構更松散， 在木質素溶解過程中其物理屏障更小[11]。

在未處理木材中， V-S和R-S中在1 270 cm-1處拉曼強度明顯高于F-S[圖3(b)和(e)]， 說明V-S和R-S含有更高含量的G型木質素。 就木質化程度而言， 導管、 射線的木質化程度也高于纖維細胞(V-S和R-S在1 598 cm-1處拉曼強度高于F-S)， 且在逐步脫木素的過程中三者相對木質素濃度關系也基本保持不變， 這可能與細胞功能有關。 導管和射線細胞作為重要的水分和營養(yǎng)物質傳輸通道， 在木材形成初期次生壁迅速加厚并木質化， 且在整個木質化階段都伴隨著G型木質素的沉積[12]； 而纖維細胞作為木材主要的機械支撐， 化學成分以纖維素為主， 纖維細胞增厚較慢， 木質化滯后， 木質素的沉積主要以S型木質素為主[13]。 因此， 高濃度的G型木質素及延長的木質化過程使得導管和射線細胞比纖維細胞更難于脫除木質素。

圖2 亞氯酸鈉脫木素過程中桉木(a—d)、 杉木(e—h)木質素分布拉曼成像

圖3 亞氯酸鈉脫木素過程中桉木(a—c)、 杉木(d—f)、 毛竹(g—i)木質素拉曼特征峰1 598 cm-1(a, d, g)、

在形態(tài)學區(qū)域， 木質素的脫除也具有高度的選擇性。 在未處理的樣品中， 無論是桉木、 杉木， 還是毛竹中， CC的木質素濃度均最高， CML次之， F-S最低。 然而， 經(jīng)亞氯酸鈉處理后， CC和CML區(qū)域木質素迅速被脫除， F-S木質素拉曼強度減少量最少(圖4)， CC木質素濃度反而最低(圖3)， 說明木質素優(yōu)先從CC和CML區(qū)域脫除。 在細胞壁生物合成過程中， 木質素與碳水化合物通過大量的化學鍵連接形成“鋼筋混泥土”結構。 F-S含有大量的碳水化合物， 該區(qū)域的木質素與碳水化合物互相交聯(lián)形成復雜的三維網(wǎng)狀結構； 而在CC和CML區(qū)域， 碳水化合物含量極少， 尤其是CC區(qū)域幾乎不含碳水化合物， 主要以木質素為主， 該區(qū)域木質素與碳水化合物化學鍵連接較少， 因此在脫木素過程中受到的阻力更小， 木質素更容易脫除。

圖4 亞氯酸鈉脫木素過程中桉木(a—c)、 杉木(d—f)、 毛竹(g—i)木質素拉曼特征峰1 598 cm-1(a, d, g)、 1 270 cm-1(b, e, h)及1 331 cm-1(c, f, i)相對強度減少百分比

2.3 亞氯酸鈉法脫木素的動力學

通過提取逐步脫木素過程中樣品的平均拉曼光譜強度變化， 我們發(fā)現(xiàn)木質素降解在前期最明顯， 尤其是前0.5 h內， 各樣品、 各區(qū)域拉曼強度減少均達80%以上， 而處理后期(1.0～1.5 h)木質素的降解程度要小得多， 大約在5%～15%。 類似的， Siqueira等[14]曾報道甘蔗渣中大量木質素在反應前期(2 h)迅速被脫除， 而后期移除13%的殘留木質素需多花一倍的時間。 研究表明， 木質素大分子間通過縮合型C—C鍵和非縮合型C—O鍵連接， 包括β-O-4， β-5， β-β， 5-5， 4-O-5等鍵型， 其中占據(jù)最大比例的β-O-4鍵比縮合結構中β-5， 5-5等鍵更容易斷裂[2, 9]。 因此， 前期優(yōu)先大量脫除的木質素可能主要以β-O-4鍵連接， 而后期較難移除的木質素主要以縮合型木質素為主。

盡管不同樹種、 不同細胞在脫木素過程中動力學總體趨勢基本一致， 但G、 S型木質素的降解在不同細胞間有著巨大區(qū)別。 通過提取G型(1 270 cm-1)、 S型(1 331 cm-1)木質素的拉曼光譜變化， 發(fā)現(xiàn)在前0.5 h內， G型木質素拉曼強度在桉木的V-S， R-S和F-S中減少量分別為62.33%， 74.27%和62.82%[圖4(b)]， 而在對應區(qū)域S型木質素拉曼強度減少程度分別為68.85%， 71.28%和70.19%[圖4(c)]， 除R-S外其他區(qū)域S型木質素拉曼強度均比G型木質素降低程度更高； 在杉木[圖4(e—f)]、 毛竹[圖4(h—i)]中， S型木質素的減少也比G型木質素約高5%～10%， 進一步證明S型木質素比G型木質素更容易脫除。 在桉木R-S中， G型木質素的脫除明顯高于V-S和F-S， 甚至高于S型木質素單體； 在杉木中， 無論哪種木質素單體， 射線細胞木質素拉曼強度的降低程度也均高于管胞。 射線細胞的脫除規(guī)律較為特殊， 這可能與細胞類型有關： 射線細胞屬于薄壁細胞， 導管和纖維細胞(闊葉材)或管胞(針葉材)屬于厚壁細胞， 亞氯酸鈉溶液滲入薄壁的射線細胞比進入厚壁細胞更容易， 因而木質素的減少更明顯。

針、 闊葉材及禾本科的脫木素規(guī)律基本相似， 但我們發(fā)現(xiàn)相同厚度切片的毛竹脫木素所需時間要明顯少于木材。 如圖3(g)所示， 毛竹脫木素處理0.5 h后其特征峰1 598 cm-1處拉曼強度變化基本趨于平穩(wěn)。 因此我們縮短檢測周期， 每隔10 min檢測一次， 發(fā)現(xiàn)毛竹在前10 min內1 598 cm-1處拉曼強度在F-S， CML和CC處就分別減少88.65%， 92.93%和91.29%， 而后期(20～60 min)拉曼強度減少只有7%～14%。 相比于木材， 竹材脫木素時間顯著縮短， 這可能與竹材中含有大量的HCA有關。 HCA與半纖維素和木質素通過酯鍵和醚鍵相連接， 在酸性亞氯酸鈉溶液中， 竹材中HCA與木質素之間的酯鍵比木材中木質素與半纖維素之間的醚鍵更容易裂解[15]， 因此大大縮短了脫木素處理時間。

3 結 論

不同樹種、 不同細胞、 不同木質素單元脫除動力學均有差異， 利用拉曼光譜可以簡單、 快速的獲得不同樹種、 組織、 細胞、 木質素單元在脫木素過程中殘余木質素含量的動態(tài)變化。 在酸性亞氯酸鈉法脫木素過程中， 大量木質素在前期迅速被脫除， 后期木質素的移除效率下降。 并且， 亞氯酸鈉法脫木素具有高度的選擇性： 在組織水平， 導管中木質素最難移除， 射線細胞次之， 纖維細胞最容易； 在形態(tài)學區(qū)域， 木質素移除率CC最高， 其次是CML， F-S最低； 對于木質素單元而言， S型木質素比G型木質素降解更容易。