童 林， 黃晨軍， 高致遠， 周 軍， 房 萌，肖 瀟， 何羽童， 洪 松， 許敏凡，朱飛飛， 高春芳

（上海東方肝膽外科醫(yī)院實驗診斷科，上海 200438）

據(jù)我國最新惡性腫瘤發(fā)病和死亡統(tǒng)計分析，我國肝癌年新發(fā)病例為37萬，發(fā)病率居第4位，年死亡病例為32.6萬，死亡率居第2位[1]。肝切除與肝移植是目前肝癌主要的治療方法，但術后復發(fā)的風險較高。微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）是原發(fā)性肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者的重要組織病理學特征及預后不良的獨立危險因素，可增加術后復發(fā)風險，導致遠期生存率降低[2-3]，伴隨MVI的HCC患者術后復發(fā)風險是無MVI患者的4.4倍[4]。因此，MVI被認為是HCC術后復發(fā)和死亡的重要原因[5]?，F(xiàn)階段MVI的診斷主要依靠肝切除術后的病理組織學檢查，將全部組織切片內(nèi)的MVI進行計數(shù)，并根據(jù)MVI的數(shù)量和分布情況進行風險分級。目前尚無可靠的術前診斷MVI的方法，而術前診斷MVI對臨床治療方案選擇和改善患者預后具有重要意義[6]。為此，本研究擬基于臨床常用檢驗項目數(shù)據(jù)建立HCC患者MVI的診斷模型。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2015年1月—2018年12月上海東方肝膽外科醫(yī)院接受手術治療的7 507例HCC患者的臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤個數(shù)、腫瘤大小、Edmondson分級、MVI發(fā)生情況及術前48項指標的檢測結(jié)果。按住院時間，將2015年1月—2017年12月住院的5 602例HCC患者作為訓練組，其中男4 764 例（85.0%）、女838例（15.0%），年齡10～85歲；將2018年1—12月住院的1 905例HCC患者作為驗證組，其中男1 631例（85.6%）、女274例（14.4%），年齡20～86歲。對所有患者進行Edmondson分級，即根據(jù)腫瘤細胞的異型程度對肝癌進行分級。Ⅰ級：癌細胞形態(tài)似正常肝細胞；Ⅱ級：癌細胞略異型；Ⅲ級：癌細胞異形明顯；Ⅳ級：癌細胞形態(tài)變異大。根據(jù)2015版原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南[7]，M0：未發(fā)現(xiàn)MVI；M1（低危組）：≤5個MVI，且發(fā)生于近癌旁肝組織區(qū)域（≤1 cm）；M2（高危組）：＞5個MVI，或MVI發(fā)生于遠癌旁肝組織區(qū)域（＞1 cm）。訓練組中M0 2 956例、M1 1 378例、M2 1 268例；驗證組中M0 931例、M1 555例、M2 419例。本研究經(jīng)上海東方肝膽外科醫(yī)院倫理委員會批準（批號：EHBHKY2018-1-009），所有對象均知情同意。

1.2 納入和排除標準

納入標準：（1）接受手術治療且術后組織病理診斷為HCC；（2）所有病例基本信息及臨床實驗室數(shù)據(jù)均完整。排除標準：（1）合并有其他器官的惡性腫瘤；（2）患嚴重的感染性疾病、重要臟器疾病；（3）術前接受其他抗腫瘤治療。

1.3 方法

采用XE2100全自動血液分析儀（日本Sysmex公司）及配套試劑（流式細胞計數(shù)法）檢測血常規(guī)指標[白細胞（white blood cell，WBC）計數(shù)、中性粒細胞絕對數(shù)（the absolute value of neutrophil，NEUT#）、淋巴細胞絕對數(shù)（the absolute value of lymphocyte，LYMPH#）、單核細胞絕對數(shù)（the absolute value of monocyte，MONO#）、嗜酸性粒細胞絕對數(shù)（the absolute value of eosinophil，EO#）、嗜堿性粒細胞絕對數(shù)（the absolute value of basophil，BASO#）、平均紅細胞血紅蛋白量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）、紅細胞（red blood cell，RBC）計數(shù)、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、血細胞比容（hematocrit，HCT）、血小板（platelet，PLT）計數(shù)、中性粒細胞百分比（the percentage of neutrophil，NEUT%）、淋巴細胞百分比（the percentage of lymphocyte，LYMPH%）、單核細胞百分比（the percentage of monocyte，M O N O%）、嗜酸性粒細胞百分比（t h e percentage of eosinophil，EO%）、嗜堿性粒細胞百分比（the percentage of basophil，BASO%）、紅細胞分布寬度（red blood cell distribution width，RDW）、血小板分布寬度（platelet distribution width，PDW）、平均紅細胞體積（mean corpuscular volume，MCV）、平均血小板體積（mean platelet volume，MPV）、血小板壓積（plateletcrit，PCT）]。采用CA7000全自動血凝分析儀（日本Sysmex公司）及配套試劑（凝固法）檢測凝血酶原時間（prothrombin time，PT）。總膽紅素（total bilirubin，TB）和直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）采用釩酸氧化法檢測，試劑購自日本和光純藥工業(yè)株式會社；唾液酸（sialic acid，SA）采用酶法檢測，試劑購自浙江東甌生物技術有限公司；ɑ-L-巖藻糖苷酶（alpha-L-fucosidase，AFU）采用速率法檢測，試劑購自上海駿實生物科技有限公司；總蛋白（total protein，TP）采用雙縮脲法檢測，白蛋白（albumin，Alb）采用溴甲酚綠法檢測，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）采用速率法檢測，γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶（gammaglutamyltransferase，GGT）采用比色法檢測，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）采用2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液法檢測，載脂蛋白A（apolipoprotein A，apo A）和載脂蛋白B（apolipoprotein B，apo B）采用免疫比濁法檢測，試劑均購自瑞士羅氏公司；以上項目的檢測儀器為MODULAR P800全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）。采用Cobas e601全自動免疫分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學發(fā)光法）檢測甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、糖類抗原199（carbohydrate antigen 199，CA199）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）及乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染相關標志物[乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎表面抗體（hepatitis B surface antibody，HBsAb）、乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）、乙型肝炎e抗體（hepatitis B e antibody，HBeAb）、乙型肝炎核心抗體（hepatitis B core antibody，HBcAb）]。甲胎蛋白異質(zhì)體（alpha-fetoprotein heterogeneity，AFP-L3）采用親和吸附離心法檢測，試劑盒購自北京熱景生物技術有限公司。采用LUMIPULSE G1200全自動免疫分析儀（日本富士公司）及配套試劑（酶化學發(fā)光法）檢測異常凝血酶原（des-gamma-carboxy prothrombin，DCP）。HBV DNA采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）熒光探針法檢測，試劑購自上?？迫A生物技術有限公司，檢測儀器為ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用非參數(shù)MannWhitneyU檢驗。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法。用單因素Logistic回歸分析評估每個變量與MVI的關系，篩選出有意義的變量再進行多因素Logistic回歸分析。通過逐步回歸分析確定診斷MVI的獨立危險因素，構(gòu)建相應的Logistic回歸模型。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC） 曲線確定Logistic回歸模型診斷有無MVI的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 訓練組與驗證組基本臨床特征的比較

訓練組與驗證組之間年齡、Alb、ALT、AST、GGT、ALP、AFU、SA、PT、腫瘤個數(shù)、腫瘤大小、MVI比例差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其他項目2個組之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 訓練組與驗證組基本臨床特征的比較

2.2 單因素 Logistic回歸分析

單因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，年齡[比值比（odds ratio，OR）=0.977，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）為0.972～0.982]、PLT（OR=1.001，95%CI為1.001～1.002）、Alb（OR=0.965，95%CI為0.951～0.979）、SA（OR=1.023，95%CI為1.018～1.028）、lgAFP（OR=1.483，95%CI為1.425～1.543）、lgDCP（OR=1.595，95%CI為1.513～1.683）、AFP-L3（OR=1.027，95%CI為1.024～1.031）、AFP-L3（定性）（OR=2.445，95%CI為2.193～2.727）、HBsAg（定性）（OR=1.272，95%CI為1.095～1.477）、HBeAg（定性）（OR=1.265，95%CI為1.117～1.432）等35個指標是MVI發(fā)生的危險因素，其他項目與MVI均無關系。見表2。

表2 基于訓練組有無MVI的單因素Logistic回歸分析

2.3 多因素Logistic回歸分析

多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，年齡（OR=0.981，95%CI為0.976～0.986）、PLT計數(shù)（OR=0.998，95%CI為0.997～0.999）、Alb（OR=0.971，95%CI為0.957～0.986）、SA（OR=1.016，95%CI為1.009～1.022）、lgAFP（OR=1.226，95%CI為1.163～1.292）、lgDCP（OR=1.361，95%CI為1.282～1.445）、AFP-L3（OR=1.012，95%CI為1.008～1.016）是MVI發(fā)生的危險因素。見表3。

2.4 聯(lián)合診斷模型的建立及診斷MVI的效能

根據(jù)Logistic回歸分析結(jié)果建立的聯(lián)合診斷模型PA-SALAD=0.220-0.002×PLT-0.019×年齡+0.0 1 6×S A-0.0 2 9×A l b+0.0 1 2×AFP-L3+0.204×lgAFP+0.308×lgDCP。將M1和M2合并為有MVI，M0為無MVI。

表3 基于訓練組有無MVI多因素Logistic回歸分析

ROC曲線分析結(jié)果顯示，在訓練組中，PA-SALAD模型診斷有MVI的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.695，最佳臨界值為-0.235 3，敏感性為69.3%，特異性為60.4%。在驗證組中，以訓練組的最佳臨界值-0.235 3作為臨界值，PA-SALAD模型診斷有MVI的AUC為0.704，敏感性為66.5%，特異性為62.0%；區(qū)分M0與M1的AUC為0.664，敏感性為60.0%，特異性為62.0%；區(qū)分M0與M2的AUC為0.758，敏感性為75.2%，特異性為62.0%；區(qū)分M1與M2的AUC為0.613，敏感性為75.2%，特異性為40.0%。見表4、圖1。

表4 PA-SALAD模型診斷HCC患者術前發(fā)生MVI的效能

圖1 PA-SALAD模型診斷訓練組和驗證組MVI的ROC曲線

3 討論

肝切除和肝移植術后通過病理檢查證實MVI的發(fā)生率為15.0%～57.1%[5]。盡管MVI的發(fā)生機制尚未明確，但有研究結(jié)果顯示，進行肝移植的HCC患者如未發(fā)現(xiàn)MVI，其預后會更好[8]。影像學檢查[電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）或磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）]是HCC患者術前診斷MVI的常用方法，但影像學檢查存在許多局限性，如結(jié)果受醫(yī)生經(jīng)驗影響較大、不適合大樣本處理、診斷標準難以統(tǒng)一等[9]。

近年來，許多學者嘗試使用影像學檢查結(jié)合實驗室指標對MVI進行術前診斷。ZHAO等[10]以AFP＞400 μg/L、 GGT＞130 U/L、腫瘤總直徑＞8 cm、腫瘤數(shù)目＞3個為參數(shù)建立預測MVI的評分系統(tǒng)，其特異性接近90%，但該研究納入的樣本量較小。梁志銀等[6]以腫瘤最大直徑、AFP＞200 μg/L、ALP＞60 U/L、TB＞15 μmol/L為參數(shù)建立列線圖，對HCC患者發(fā)生MVI進行預測，該列線圖具有一定的可靠性，但敏感性和特異性均較低。CUCCHETTI等[11]采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡建立MVI預測模型，在訓練組和驗證組中，該模型診斷MVI的AUC均超過0.9，準確性較高，但是該模型的應用需要借助復雜的計算機軟件，其推廣受到一定的限制。

術前診斷MVI的方法目前臨床尚無統(tǒng)一的標準。為此，本研究嘗試用臨床常用檢驗項目數(shù)據(jù)建立模型來判斷HCC患者有無MVI。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，年齡（OR=0.981，95%CI為0.976～0.986）、PLT（OR=0.998，95%CI為0.997～0.999）、Alb（OR=0.971，95%CI為0.957～0.986）、SA（OR=1.016，95%CI為1.009～1.022）、lgAFP（OR=1.226，95%CI為1.163～1.292）、lgDCP（OR=1.361，95%CI為1.282～1.445）、AFP-L3（OR=1.012，95%CI為1.008～1.016）是MVI發(fā)生的危險因素，依此建立聯(lián)合診斷模型PASALAD。在訓練組和驗證組中，PA-SALAD模型術前診斷有無MVI（M0與M1+2）的AUC分別為0.695、0.704，敏感性分別為69.3%、66.5%，提示建立的聯(lián)合診斷模型對判斷HCC患者術前是否發(fā)生MVI有較好的價值。

日本肝臟學會（Japan Society of Hepatology，JSH）指南推薦使用腫瘤標志物AFP、AFP-L3和DCP三聯(lián)檢的監(jiān)測程序，對乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒相關慢性肝病患者進行早期HCC篩查[12]，腫瘤標志物水平升高可提示HCC的侵襲性風險升高[13]。本研究結(jié)果顯示，AFP、AFP-L3和DCP水平升高會增加MVI發(fā)生的風險。PA-SALAD模型顯示高齡HCC患者發(fā)生MVI的風險低于低齡患者，與胡月雷等[14]的研究結(jié)果[HCC低齡（＜60歲）患者MVI發(fā)生率明顯高于高齡（≥60歲）患者]和SHEN等[15]的研究結(jié)果[≤55歲的HCC患者發(fā)生MVI的比例明顯高于＞55歲的患者]一致。本研究結(jié)果還顯示，PLT計數(shù)和Alb水平降低可增加MVI發(fā)生的風險，與ZHENG等[16]的研究結(jié)果[術前低Alb與MVI發(fā)生密切相關]和LEI等[17]的研究結(jié)果[較低的PLT水平與早期肝癌MVI發(fā)生的可能性增加有關]相符。

SA是細胞膜上糖蛋白、糖脂的重要組成成分。在正常生理過程中，血清SA水平保持相對穩(wěn)定，當肝細胞發(fā)生癌變后，癌基因的高表達使得細胞膜產(chǎn)生大量糖蛋白和糖脂，導致蛋白SA化修飾程度明顯增強，SA隨肝癌細胞的脫落和分泌進入機體血液循環(huán)系統(tǒng)，造成肝癌患者血清SA水平升高，因此SA與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲密切相關[18]。還有研究結(jié)果顯示，血清SA與肝硬化的惡性程度呈正相關，隨著肝硬化病情的加重，血清SA水平也逐步升高，而肝硬化被認為是MVI發(fā)生的獨立危險因素[19-20]，這與本研究結(jié)果一致。

ROC曲線結(jié)果顯示，以-0.235 3為臨界值，PA-SALAD模型區(qū)分M0與M2的AUC為0.758，敏感性為75.2%，特異性為62.0%，準確性為66.1%，說明該模型對診斷HCC患者是否發(fā)生高危MVI具有較高的價值。PA-SALAD模型區(qū)分M0與M1及M1與M2的AUC分別為0.664和0.613，表明該模型對低危MVI的診斷以及區(qū)分MVI嚴重程度的能力有限。

綜上所述，本研究基于臨床常用指標建立了術前診斷HCC患者是否發(fā)生MVI的模型，該模型具有較好的臨床應用價值。由于本研究為單中心回顧性分析，因此仍需進行大樣本的多中心前瞻性驗證，以便為臨床診斷HCC患者術前MVI發(fā)生提供堅實的循證醫(yī)學證據(jù)。