杜晶輝， 李 莎， 劉 旭

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

2019 年12月發(fā)現(xiàn)于我國武漢的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）目前已成全球蔓延趨勢，在COVID-19的診治中，實(shí)驗室檢測起到了至關(guān)重要作用。在這一新發(fā)傳染病的救治過程中，各醫(yī)療機(jī)構(gòu)結(jié)合診治實(shí)踐，總結(jié)出COVID-19的重要實(shí)驗室檢驗指標(biāo)，并編制了臨床路徑[1-2]，包括確診、鑒別診斷和輔助診斷3部分。目前，關(guān)于鑒別診斷檢測技術(shù)的研究相對較少，確定診斷檢測技術(shù)中病毒核酸檢測是重要手段，血清抗體檢測也可作為確診指標(biāo)。輔助診斷檢測技術(shù)主要是在疾病治療中發(fā)揮作用。我們對COVID-19的確定診斷、鑒別診斷和輔助診斷相關(guān)實(shí)驗室檢測技術(shù)進(jìn)行概述。

1 COVID-19確定診斷實(shí)驗室檢測技術(shù)

1.1 病原學(xué)診斷

病原學(xué)診斷主要包括病毒的分離培養(yǎng)和核酸檢測。病毒分離培養(yǎng)是實(shí)驗室診斷病毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是由于該方法檢測時間長（體外分離培養(yǎng)需要6 d）、生物安全等級要求高（P4實(shí)驗室），因此在臨床上的開展受到限制[3]。嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）核酸檢測方法較多，包括逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）、等溫核酸擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術(shù)、依賴核酸序列擴(kuò)增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)、基于成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/及其相關(guān)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein，CRISPR/Cas）基因核酸檢測技術(shù)、基因芯片技術(shù)、基因測序等。其中，實(shí)時熒光RT-PCR及基因測序為相關(guān)部門推薦的檢測方法[4]。

1.1.1 實(shí)時熒光RT-PCR SARS-CoV-2的基因組為單鏈正RNA，需先通過反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)的cDNA鏈，再以cDNA鏈為基礎(chǔ)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[5]。截至2020年4月27日，我國國家藥品監(jiān)督管理局（the National Medical Products Administration，NMPA）共批準(zhǔn)了19個SARS-CoV-2核酸檢測試劑（表1）。熒光RT-PCR主要分為二重實(shí)時熒光RT-PCR和三重實(shí)時熒光RT-PCR（均為Taqman探針法）。二重檢測的靶基因主要是RdRp基因[位于開放讀碼框1a/b（open reading frame 1ab，ORF1ab）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）]；三重檢測的靶基因是RdRp基因、N基因和包膜蛋白（envelope protein，E）基因。有研究團(tuán)隊已經(jīng)對6種不同品牌的試劑盒進(jìn)行了比較，得出了部分試劑的準(zhǔn)確性、靈敏度及重復(fù)性欠佳的結(jié)論[6]。

表1 NMPA批準(zhǔn)的SARS-CoV-2核酸檢測試劑（截至2020年4月27日）

實(shí)時熒光RT-PCR檢測核酸的方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、相對基因測序速度快、可批量化和成本低的優(yōu)點(diǎn)，但相對血清抗體檢測，其對實(shí)驗場所及人員要求高、操作繁瑣、耗時長，檢測人員感染風(fēng)險高，結(jié)果受樣本質(zhì)量、實(shí)驗條件及人員操作等因素影響較大[7]，特別是假陰性問題，使核酸檢測的作用一度被質(zhì)疑。假陰性結(jié)果主要由樣本質(zhì)量、樣本采集時間與病毒含量、樣本的保存、運(yùn)輸和處理及試劑盒本身的局限性、檢驗操作等因素導(dǎo)致，已有許多研究針對這些因素提出了對策：（1）樣本質(zhì)量。下呼吸道樣本（深部痰、肺泡灌洗液或支氣管灌洗液等）較上呼吸道樣本（鼻咽拭子）更易檢出病毒，但COVID-19患者一般為干咳無痰，灌洗液樣本采集難度大、危險系數(shù)高；采集下呼吸道樣本一般可在插管的患者中進(jìn)行，上呼吸道樣本建議采集鼻拭子，或同時采集鼻拭子和咽拭子，放入同一個采集管中，采集拭子宜采用植絨拭子[8-9]。（2）樣本采集時間與病毒含量。隨著病程的進(jìn)展，不同部位的病毒含量是不同的，因此不同病程應(yīng)采用不同方法采集不同部位的樣本[10]。（3）樣本的保存、運(yùn)輸和處理。RNA病毒核酸穩(wěn)定性較差，樣本采集后應(yīng)該盡快進(jìn)行檢測，24 h內(nèi)檢測可置于4 ℃保存，無法24 h內(nèi)檢測，應(yīng)-70 ℃或以下保存。樣本的運(yùn)輸應(yīng)在4 ℃進(jìn)行，運(yùn)輸容器應(yīng)有病毒保存液[11]。（4）試劑盒本身的局限性。應(yīng)急研發(fā)生產(chǎn)的試劑盒缺少完整的臨床應(yīng)用和方法學(xué)驗證，實(shí)驗室在使用不同批號試劑前應(yīng)做相應(yīng)的性能驗證[6]。選擇至少包含最為保守及特異的ORF1ab區(qū)域以及N基因的試劑盒[12]。（5）檢驗操作。磁珠法是較為常用的核酸提取方法，具有簡便、高效、提取濃度及純度較高等優(yōu)點(diǎn)[11]，實(shí)驗室應(yīng)參加室間質(zhì)評并做好室內(nèi)質(zhì)控，指派專業(yè)人員進(jìn)行檢測。針對核酸檢測的假陰性問題，大多學(xué)者建議以血清抗體檢測作為SARS-CoV-2核酸檢測陰性疑似病例的補(bǔ)充檢測，或在疑似病例確診時與核酸檢測協(xié)同應(yīng)用[13]。結(jié) 果判讀應(yīng)結(jié)合各品牌試劑說明書（表2）。

表2 SARS-CoV-2的實(shí)時熒光PT-PCR檢測結(jié)果判讀

1.1.2 基因測序 基因測序可對樣本中未知基因組序列進(jìn)行全新測定和鑒定，以確認(rèn)未知病原體基因組信息。我國學(xué)者利用二代測序的宏基因組學(xué)技術(shù)，于2020年1月7日從患者體內(nèi)分離出SARS-CoV-2并進(jìn)行了基因組測序，并于2020年1月12日向世界衛(wèi)生組織上報了相關(guān)信息?；驕y序技術(shù)可用于未知感染性疾病宏基因組學(xué)分析和傳染病監(jiān)控，快速應(yīng)對新型傳染性疾病的暴發(fā)，提高對疾病發(fā)生和傳播的理解，并進(jìn)行數(shù)據(jù)共享，指導(dǎo)核酸檢測產(chǎn)品的設(shè)計等[14]。還可幫助了解病毒的遺傳信息，對病毒進(jìn)行追蹤和溯源，為臨床診斷及治療提供科學(xué)依據(jù)，并為病原學(xué)、免疫學(xué)和流行病學(xué)研究奠定基礎(chǔ)[15]。

基因測序技術(shù)的高敏感性、高準(zhǔn)確性特點(diǎn)較適用于最初病毒的鑒定和后期病毒的進(jìn)一步研究，以及對疑難病例的診斷與鑒別診斷[16]，但由于對實(shí)驗室環(huán)境、設(shè)備和人員素質(zhì)的要求較高（專業(yè)人員對序列的解讀），且耗時長、成本高，不適合用于SARS-CoV-2的快速、大批量的常規(guī)檢測[17]。

1.2 血清抗體檢測

人體感染SARS-CoV-2后，病毒會作為抗原刺激人體免疫細(xì)胞產(chǎn)生抗體，因此可以通過檢測人體內(nèi)是否產(chǎn)生特異性的抗體來間接判斷是否感染SARS-CoV-2。檢測的抗體主要分為IgM和IgG 2類。IgM抗體是機(jī)體初次免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體，產(chǎn)生速度快，但濃度低、維持時間短、親和力差，主要提示現(xiàn)階段被感染的狀態(tài)，可作為早期感染的指標(biāo)；IgG抗體在感染晚期出現(xiàn)，濃度高、維持時間長、親和力好，可提示既往感染。SARS-CoV-2進(jìn)入人體后到產(chǎn)生IgM抗體約為1周時間，但目前暫無針對COVID-19的抗體檢測窗口期及2次檢測間隔時間的研究，因此何時進(jìn)行第1次和第2次血清抗體檢測，目前尚無共識。

抗體檢測的樣本主要是血清、血漿或全血，檢測技術(shù)主要分為3類：化學(xué)發(fā)光法、膠體金免疫層析法和酶聯(lián)免疫吸附試驗。截至2020年4月27日，NMPA共批準(zhǔn)11個SARS-CoV-2抗體檢測試劑，其中膠體金法6個，化學(xué)發(fā)光法5個。目前，對COVID-19血清抗體檢測的研究主要集中在膠體金免疫層析法，但是相關(guān)文件中提出需要進(jìn)行IgG抗體4倍升高的檢測[4]，我們認(rèn)為只使用定性的膠體免疫層析法是不能完全滿足要求的。

化學(xué)發(fā)光法靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測范圍寬，操作自動化高，檢測速度快，但容易檢測出低值的抗體量，假陽性偏高，且需要化學(xué)發(fā)光儀，成本較高。使用化學(xué)發(fā)光法測定IgM和IgG臨床特異度可以高達(dá)96.20%和92.41%[18]?；瘜W(xué)發(fā)光法測定總抗體優(yōu)于膠體金免疫層析法，化學(xué)發(fā)光法檢測IgM適用于疾病的各個階段[19]。膠體金免疫層析法檢測樣本采集易標(biāo)準(zhǔn)化（全血樣本）、操作簡單、報告時間快（約15 min）[13]，適用于快速篩查，特異性較高，無需特殊設(shè)備（目視判定結(jié)果），有輔助診斷的價值[20]，然而其檢測靈敏度和準(zhǔn)確度相對化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫吸附試驗低，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，建議與其他方法聯(lián)用。酶聯(lián)免疫吸附試驗具有特異性強(qiáng)、靈敏度高（較膠體金免疫層析法）的特點(diǎn)，載體標(biāo)準(zhǔn)化難度較低，成本相對化學(xué)發(fā)光法低，但檢測速度慢（1～2 h）、易污染、步驟較為繁瑣，檢測通量相對較小[21]，截至3月16日，尚無NMPA批準(zhǔn)的試劑。ZHANG等[22]采用酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒檢測IgG和IgM，連續(xù)監(jiān)測15例COVID-19患者IgG和IgM的滴度變化，發(fā)現(xiàn)采樣第5天，IgG的陽性率（81%～100%）和IgM的陽性率（50%～81%）都大幅增加，這與核酸檢測相對較低的陽性檢出率（50%）相反。由于酶聯(lián)免疫吸附試驗的性能介于化學(xué)發(fā)光法和膠體金免疫層析法之間，但檢測時間較長，在COVID-19診斷中未見優(yōu)勢，故相關(guān)研究較少。

核酸檢測聯(lián)合抗體檢測結(jié)果判讀見表3。

表3 SARS-CoV-2核酸檢測聯(lián)合血清抗體檢測結(jié)果判讀

抗體檢測操作簡單，對實(shí)驗環(huán)境及人員要求較低，且僅需采集血液標(biāo)本（相對核酸樣本采集風(fēng)險較低）。有研究結(jié)果表明，56 ℃ 30 min滅活處理血液樣本對免疫層析法及化學(xué)發(fā)光免疫分析法（熒光免疫層析法除外）檢測SARS-CoV-2抗體結(jié)果幾乎無影響，因此可在檢測前先進(jìn)行滅活以降低檢驗人員感染風(fēng)險[23]，可用于COVID-19的早期診斷、流行病學(xué)篩查和臨床轉(zhuǎn)歸預(yù)測，是快速篩查和核酸輔助診斷的重要方法[13]。但樣本溶血或紅細(xì)胞、纖維蛋白未離心去除、細(xì)菌污染、患者自身抗體、嗜異性抗體引起假性非特異性反應(yīng)會造成假陽性結(jié)果[24]。采用防腐劑、抗凝劑等處理樣本，樣本在冰箱中保存過久，試劑使用前未平衡至室溫，用量不足，溫育時間或溫度不足，受到污染或失效（酶聯(lián)免疫吸附試驗），層析過快（膠體金免疫層析法）等，都會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。單獨(dú)使用SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體在早期診斷與篩查COVID-19時存在較大的漏診和一定的誤診風(fēng)險，同時檢測IgM、IgG抗體可以提高檢測的準(zhǔn)確性，減少漏診[25]。有研究結(jié)果表明，血清學(xué)檢測SARS-CoV-2陽性率比較高，將核酸檢測和血清學(xué)檢測結(jié)果綜合分析，可能提高檢出率[26]。

2 COVID-19鑒別診斷相關(guān)實(shí)驗室檢測技術(shù)

SARS-CoV-2感染所致COVID-19的臨床特征與普通病毒性肺炎相似，需要與其他病原體引起的社區(qū)獲得性肺炎進(jìn)行鑒別診斷[27]，進(jìn)行呼吸道病原體檢測是將COVID-19與其他呼吸道病毒（流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒等）及肺炎支原體、肺炎衣原體、肺炎鏈球菌等引起的肺炎進(jìn)行區(qū)分的必要措施。當(dāng)患者在非疫區(qū)，且無明顯流行病學(xué)接觸史時，應(yīng)酌情篩查上述病原體，排除這些病原體引起的肺炎，從而做到疾病的早期鑒別診斷[28]。

由于COVID-19疑似患者首先于發(fā)熱門診就診，為更好地做到早發(fā)現(xiàn)、早隔離，在檢測項目的選擇上應(yīng)該首先考慮膠體金技術(shù)、微流控芯片技術(shù)等快速、集成化、高通量的檢測技術(shù)[29-30]。四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗室推薦檢測甲/乙型流感病毒抗原篩查、13種常見呼吸道病毒核酸檢測、肺炎支原體抗體、肺炎衣原體抗體和呼吸道樣本細(xì)菌培養(yǎng)等[2]。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院張國軍團(tuán)隊對出現(xiàn)流感樣癥狀且經(jīng)胸部影像學(xué)檢查證實(shí)存在下呼吸道感染的發(fā)熱門診就診患者進(jìn)行膠體金甲/乙型流感病毒抗原抗體檢測，從而快速與SARS-CoV-2感染患者進(jìn)行鑒別診斷[31]。針對社區(qū)獲得性肺炎常見的肺炎鏈球菌檢測，有學(xué)者建議使用肺炎鏈球菌尿抗原檢測的方法實(shí)現(xiàn)快速檢測[32]。

在結(jié)果判讀時，呼吸道病原體檢測全部為陰性，臨床表現(xiàn)具有病毒性肺炎特征，即使SARS-CoV-2核酸檢測陰性，也應(yīng)重新取陽性率更高的樣本進(jìn)行核酸檢測，或結(jié)合血清學(xué)抗體檢測進(jìn)一步判讀結(jié)果。對COVID-19確診患者也應(yīng)酌情增加呼吸道病原體檢測，根據(jù)是否合并其他病原感染[17]來調(diào)整治療方案。

3 輔助診斷相關(guān)實(shí)驗診斷技術(shù)

輔助診斷相關(guān)的實(shí)驗診斷技術(shù)包括血液炎性指標(biāo)（血常規(guī)、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原和血清淀粉樣蛋白A等）、生化指標(biāo)（肝功能、腎功能、心功能、血?dú)夥治龅龋?、免疫指?biāo)（促炎細(xì)胞因子、趨化因子及淋巴細(xì)胞亞群）等。血液炎性指標(biāo)可用于COVID-19的初步鑒別診斷，張國軍團(tuán)隊確證了幾類血常規(guī)標(biāo)志物的鑒別屬性，可以作為核酸檢測的一個有效補(bǔ)充。但是SARS-CoV-2引起的感染較為復(fù)雜，單純依靠血液炎性指標(biāo)進(jìn)行鑒別診斷較困難[31]。生化指標(biāo)檢測技術(shù)主要是通過器官功能檢測判斷和機(jī)體損傷情況，進(jìn)而調(diào)整治療方案，SARS-CoV-2與器官損傷具有一定相關(guān)性，對肝功能、腎功能等器官功能進(jìn)行檢測，可有效判斷病情變化。但對患者進(jìn)行肝、腎、心功能檢測并不能判斷SARS-CoV-2直接損傷組織器官的嚴(yán)重程度，應(yīng)考慮治療藥物是否對這些組織器官造成了損傷。由于SARS-CoV-2主要侵害肺組織，因此血?dú)夥治鰧τ贑OVID-19肺功能的監(jiān)測尤為重要，可作為判斷病情的標(biāo)準(zhǔn)之一[33]。針對COVID-19患者免疫反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測，對促炎細(xì)胞因子、趨化因子等進(jìn)行檢測可為臨床免疫干預(yù)提供更加準(zhǔn)確的切入點(diǎn)，從而充分控制免疫失衡，更好地發(fā)揮人體免疫功能。已經(jīng)有學(xué)者分析了中藥在遏制COVID-19引起的免疫過激、細(xì)胞因子風(fēng)暴及抗急性肺損傷中的潛在應(yīng)用價值[34]?？偠灾o助診斷相關(guān)檢測技術(shù)可以為COVID-19的嚴(yán)重程度判斷、治療方案調(diào)整、預(yù)后情況判斷、危險因素分析提供幫助，在疾病的診治中，主要是在“治”中發(fā)揮重要作用。

4 總結(jié)

COVID-19需要與常見的社區(qū)獲得性肺炎進(jìn)行鑒別診斷，針對這些社區(qū)獲得性肺炎病原體的檢測方法已經(jīng)較為成熟，包括核酸、抗原抗體等檢測技術(shù)。采取何種檢測方法，除考慮其本身的性能外，還需要考慮鑒別診斷的檢測速度與生物安全。我們認(rèn)為，由于COVID-19具有潛伏期長、可無癥狀傳播等特點(diǎn)，對其進(jìn)行鑒別診斷有更高的要求，因此在發(fā)熱門診中除采用快速、準(zhǔn)確的檢測方法，如多聯(lián)檢測的膠體金方法外，更需要充分結(jié)合流行病史、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)等綜合考慮。

COVID-19確定診斷中，核酸檢測具有多種優(yōu)勢，但是其主要問題是易受采樣、運(yùn)輸、試劑質(zhì)量及檢測技術(shù)等因素的影響出現(xiàn)假陰性結(jié)果。有學(xué)者認(rèn)為呼吸道樣本檢出率為肺組織＞支氣管肺泡灌洗液＞抽吸痰或鼻咽吸取物＞鼻咽拭子或口咽拭子＞鼻拭子[35]，但我們認(rèn)為樣本取材部位應(yīng)該結(jié)合患者臨床情況及病程進(jìn)行分析，如患者臨床表現(xiàn)為明顯的病毒血癥，建議采集乙二胺四乙酸抗凝全血進(jìn)行核酸檢測，如病程尚在感染前期，尚未發(fā)展到病毒性肺炎，肺泡灌洗液樣本的檢出率未必高于鼻咽拭子，或者同步采集鼻咽拭子，以提高檢測的陽性率。由于SARS-CoV-2核酸檢測試劑為應(yīng)急審批，性能驗證可能尚不完善，應(yīng)對比多家試劑，并進(jìn)行性能驗證，各地臨床檢驗中心應(yīng)組織開展SARSCoV-2核酸檢測的實(shí)驗室間比對。COVID-19的治療還處于探索階段，各種抗病毒藥物（如抗人類免疫缺陷病毒藥物）的使用，對核酸檢測結(jié)果可能也有影響。

血清抗體檢測技術(shù)具有快速、簡便、操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，對于其抗原抗體交叉反應(yīng)等引起的假陽性問題，可在結(jié)果判讀時結(jié)合患者臨床表現(xiàn)盡量避免，COVID-19血清抗體檢測主要的問題應(yīng)該是窗口期的假陰性問題，即何時進(jìn)行血清抗體檢測，何時進(jìn)行第2次檢測，判斷4倍升高是亟需解決的問題，其IgM抗體、IgG抗體產(chǎn)生時間是否與其他病毒類似，目前也尚無有效方法加以判斷。

COVID-19明確診斷后，需要根據(jù)疾病嚴(yán)重程度選擇不同的治療方案，在疾病的治療過程中需要對組織臟器進(jìn)行功能監(jiān)測，從而不斷調(diào)整治療方案，治療過程中需要對疾病的風(fēng)險因素進(jìn)行評估，對患者預(yù)后進(jìn)行判斷。整個治療過程中都需要輔助診斷檢測技術(shù)給予幫助。

綜上所述，不同的實(shí)驗室檢測技術(shù)各有利弊，在COVID-19診斷中應(yīng)該聯(lián)合使用，取長補(bǔ)短，同時應(yīng)該綜合考慮患者的流行病學(xué)特征、病程、病史、用藥情況、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)等，早發(fā)現(xiàn)、早治療。