侯艷艷， 范基農(nóng)， 劉湘帆， 倪培華

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗系，上海 200025；2.上海市臨床檢驗中心，上海 200126）

環(huán)形RNA（circular RNA，circRNA）是一種新型的非編碼RNA，是由前體RNA的5'端和3'端共價閉合形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其多數(shù)定位于細胞質(zhì)，且序列高度保守，不易被核酸酶降解，在體內(nèi)非常穩(wěn)定，并具有組織或發(fā)育階段特異性。高度豐富并進化保守的circRNA已被發(fā)現(xiàn)在心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、感染和癌癥中發(fā)揮重要作用。我們主要討論circRNA在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中的作用，包括腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，并進一步展望circRNA對腫瘤的篩查、診斷、預(yù)后評估以及靶向治療的可能性。

1 circRNA的形成、生物特征、作用機制與檢測方法

circRNA在真核細胞中分布廣泛，且具有許多顯著特性和重要生物學(xué)功能，因此成為非編碼RNA領(lǐng)域的研究熱點。

circRNA根據(jù)不同的組成和循環(huán)機制可以分為4類：外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA、外顯子-內(nèi)含子circRNA和tRNA內(nèi)含子所形成的circRNA。目前存在3種假設(shè)模型來解釋外顯子circRNA的形成[1]。（1）套索驅(qū)動的環(huán)化，指由外顯子組成的剪接供體和剪接受體共價結(jié)合；（2）內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化，由2個內(nèi)含子互補配對結(jié)合從而形成環(huán)化結(jié)構(gòu)；（3）RNA結(jié)合蛋白誘導(dǎo)的環(huán)化，由前體RNA的內(nèi)含子兩側(cè)的RNA結(jié)合蛋白相互作用形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，發(fā)生末端連接，形成circRNA。

circRNA是一類具有顯著特征的RNA分子。（1）高豐度，circRNA廣泛表達于各種物種中，在人類細胞中circRNA占所有轉(zhuǎn)錄本的10%以上[2]；（2）穩(wěn)定性，無5'帽子和3'poly A尾的結(jié)構(gòu)特征使環(huán)狀RNA具有對核糖核酸酶的消化抗性，大多數(shù)環(huán)形RNA的半衰期超過48 h，而其線性對應(yīng)物的半衰期＜20 h[3]；（3）保守性，circRNA的保守性主要表現(xiàn)為哺乳動物之間circRNA的共同表達，例如，大約15 000個circRNA在人類和小鼠的同源基因座中均有表達，分別占人類和小鼠circRNA總量的15%和40%[4]；（4）特異性，circRNA通常以細胞特異性和組織特異性方式表達，例如由外顯子組成的circRNA通常位于細胞質(zhì)中[5]；（5）在人類和小鼠中，circRNA傾向于在大腦和血小板中富集[6]。

目前研究認為，circRNA具有強大的生物學(xué)功能。（1）通過“海綿作用”吸附微小RNA（microRNA，miRNA）。circRNA上存在miRNA結(jié)合位點，可以結(jié)合特定的miRNA，調(diào)節(jié)miRNA和mRNA的結(jié)合，發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA的功能。高水平的circ_0020710可以通過結(jié)合miR-370-3p來上調(diào)趨化因子CXC配體12（CXC-motif-chemokine 12，CXCL12）表達。CXCL12的下調(diào)可逆轉(zhuǎn)由circ_0020710表達引起的黑色素瘤細胞的惡性行為[5]。（2）吸附RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding protein，RBP）。在細胞質(zhì)中表達的circRNA能與蛋白質(zhì)結(jié)合，進而抑制蛋白質(zhì)向細胞核的運輸。circZKSCAN1可充當(dāng)RBP海綿，與脆性X智力低下蛋白（fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP）靶基因CCAR1競爭，隨后使Wnt/β-catenin信號通路失活從而抑制腫瘤行為[7]。（3）編碼蛋白質(zhì)和多肽。circ-MALAT1在臨床肝細胞癌樣本的癌癥干細胞中高表達，circMALAT1通過與核糖體和mRNA形成三元復(fù)合物，阻止PAX5 mRNA的翻譯并促進癌癥干細胞的自我更新[8]。（4）調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和選擇性剪切。circRNA可通過與RNA聚合酶Ⅱ以及其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用來調(diào)節(jié)親本基因的表達。

目前用于檢測circRNA的方法有很多種，各個檢測方法都有一定的優(yōu)點與局限性，見表1。

表1 常用檢測circRNA的方法

2 circRNA在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中的作用

circRNA在腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，在細胞周期、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，以及增殖與轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路中circRNA作用均有最新成果。

2.1 circRNA對細胞周期相關(guān)蛋白/激酶的調(diào)控

細胞周期的進展是高度有序、逐步發(fā)生的，主要受cyclin細胞周期素、細胞周期素依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）以及細胞周期素依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI）的控制。因此，細胞周期各階段推進的核心機制是cyclin、CDK、CKI之間合成組裝、修飾活化、拆卸降解和轉(zhuǎn)換的過程。

circRNA參與調(diào)節(jié)周期蛋白或激酶的表達，被認為是細胞周期的基本參與者。ZHENG等[14]發(fā)現(xiàn)，來源于NR3C1的circRNA（circNR3C1）在膀胱癌組織和細胞系中表達量顯著下調(diào)，circNR3C1直接作用于miR-27a-3p可阻止其與cyclinD1 mRNA 5'UTR的相互作用，并隨后通過抑制cyclin D1蛋白的表達來抑制細胞周期進程。同樣，在肝癌細胞中has-circ-0000204可以通過“海綿作用”吸附miR-191，miR-191的上調(diào)抑制了Kruppel樣因子6（Krüppel-like factor 6，KLF6） mRNA和蛋白表達，從而促進了G1-S/G2-M期的過渡[15]，KLF6屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員，其靶標(biāo)蛋白有P21、cyclin D、c-MYC等，在細胞增殖和細胞周期中扮演著非常重要的角色。circ-ZKSCAN1是使用circRNA微陣列技術(shù)在膀胱癌中篩選出表達顯著下降的circRNA，circ-ZKSCAN1可以充當(dāng)miR-1178-3p海綿，通過削弱miR-1178-3p使靶標(biāo)蛋白P21的mRNA和蛋白表達上調(diào)，進而其抑制膀胱癌細胞的增殖和侵襲[16]。與此類似，BCRC-3在膀胱癌組織中表達降低，通過RNA下拉實驗確認miR-182-5p是其唯一結(jié)合的miRNA，P27是miRNA結(jié)合的靶基因，因此circ-BCRC-3可以直接結(jié)合膀胱癌細胞中的miR-182-5p，從而促進下游效應(yīng)子p27的表達[17]。DU等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，circ-Foxo3的表達抑制了細胞增殖和細胞周期進程，circ-Foxo3在細胞內(nèi)可以與P21、CDK2形成circ-Foxo3/p21/CDK2三元復(fù)合物，這個復(fù)合物的形成，不但使p21阻止了CDK2作用于cyclin E，避免了cyclin E/CDK2復(fù)合物的形成，從而阻斷了G1期向S期的過渡，同時其還能消除p21對cyclin A/CDK2復(fù)合物的抑制作用，從而阻斷S期細胞周期的進展。同樣，circ-Ccnb1可以與cyclin B1和CDK1結(jié)合，從而解除cyclin B1/CDK1復(fù)合物的形成和核轉(zhuǎn)移，使Ccnb1和CDK1不能發(fā)揮有絲分裂活性，抑制了腫瘤的生長并延長了小鼠的生存能力[19]。

2.2 CircRNA與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）是細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵驅(qū)動因素，其中上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadhefin，E-cad）的表達下降是EMT的重要標(biāo)志。Snail、Twist、Slug和ZEB等EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子可以與E-cad的E-box結(jié)合調(diào)節(jié)EMT。

Snail是轉(zhuǎn)錄阻遏物，它與E-box序列的調(diào)節(jié)區(qū)和啟動子結(jié)合，調(diào)節(jié)許多不同基因的表達，并以此方式調(diào)節(jié)EMT。在膀胱尿道上皮癌中，circPRMT5的表達上調(diào)且circPRMT5會吸附miR-30c，通過circPRMT5/miR-30c/Snail1/E-cadherin途徑促進尿道上皮癌細胞的EMT[20]。同樣，在宮頸癌細胞中發(fā)現(xiàn)circRNA_000284上調(diào)，miR-506已被鑒定為circRNA-000284相關(guān)miRNA，Snail-2是miR-506的直接靶標(biāo)，因此，circRNA-000284可以間接增加Snail-2的表達并促進侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。ZEB由ZEB1和ZEB2組成，與Snail基因家族成員相似，ZEB家族成員通過其2個鋅指結(jié)構(gòu)域與E-cadherin基因啟動子中的E-box結(jié)合并觸發(fā)EMT。例如CircNUP214在甲狀腺乳頭狀癌細胞中發(fā)揮致癌作用，CircNUP214充當(dāng)miR-145的海綿，而ZEB2是miR-145的功能靶標(biāo)，CircNUP214/miR-145/ZEB2軸在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用[22]。Twist是一種重要的EMT，可直接或間接控制EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。有研究結(jié)果表明，Twist1通過與泛素化連接酶2（Cullin 2，Cul2）啟動子結(jié)合來促進Cul2轉(zhuǎn)錄并上調(diào)Cul2的circRNA（circ-10720）表達，但抑制Cul2表達，circ-10720與Twist1正相關(guān)，并促進了EMT進展，因此circ-10720通過吸附miR-490-5p來上調(diào)波形蛋白的表達[23]。KLF屬于含鋅指的轉(zhuǎn)錄因子家族，可調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡。ciRS-7在食管鱗狀細胞癌中過表達，并可通過調(diào)節(jié)miR-7/KLF4軸和激活核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）-p65信號來觸發(fā)食管鱗狀細胞癌的遷移和侵襲[24]。

除了以上circRNA在轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用外，某些circRNA還通過直接或間接調(diào)節(jié)細胞黏附分子和細胞骨架蛋白的表達來發(fā)揮作用。例如：波形蛋白[25]、原鈣黏蛋白α[26]、神經(jīng)性鈣黏素[27]等，此類失調(diào)的circRNA可以充當(dāng)腫瘤抑制因子或致癌基因，以控制細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。我們總結(jié)了近年來circRNA在腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中的作用，見表2。

2.3 circRNA與生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路

circRNA除了對上述蛋白分子進行調(diào)控之外，還對腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的相關(guān)通路發(fā)揮著重要作用。SU等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，circRIP2可吸附miR-1305，升高膀胱癌中的TGF-β2，并通過TGF-β2/Smad3途徑誘導(dǎo)EMT，在膀胱癌中阻斷TGF-β2會使circRIP2誘導(dǎo)的癌癥進展和EMT喪失。CircMYO10通過吸附miR-370-3p上調(diào)RUVBL1促進染色質(zhì)重塑而促進骨肉瘤進展，RUVBL1與β-catenin/LEF1復(fù)合物的結(jié)合增強β-catenin/LEF1復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄活性[29]。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，circNFIX通過靶向miR-34a-5p調(diào)控Notch1和Notch信號通路[30]。ZHANG等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌中有較高的circNRIP1表達，circNRIP1的下游是miR-149-5p，通過circNRIP1-miR-149-5p-Akt1/mTOR軸負責(zé)胃癌細胞中新陳代謝的改變，Akt/mTOR途徑是介導(dǎo)腫瘤代謝穩(wěn)態(tài)的經(jīng)典信號途徑之一，對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移有益。circRNA-000911在乳腺癌細胞中起抗癌作用，miR-449a是circRNA-000911潛在的miRNA，circRNA-000911通過使miR-449a海綿化而正向調(diào)節(jié)Notch1表達，有學(xué)者鑒定出NF-κB信號通路是circRNA-000911/miR-449a途徑的功能靶標(biāo)[32]。見表2。

表2 circRNA在腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中的作用

3 總結(jié)和展望

circRNA的發(fā)現(xiàn)豐富了人們對腫瘤生物學(xué)的認知，加深了對RNA更全面的理解，使其成為腫瘤生長和轉(zhuǎn)移研究領(lǐng)域的熱點，也為檢驗診斷開拓了新方向。常規(guī)檢驗已經(jīng)被證明是很有前途的，但是開發(fā)臨床驗證的腫瘤檢測生物標(biāo)志物仍是一個挑戰(zhàn)。近年來，circRNA在腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移方面是非常有潛力的腫瘤標(biāo)志物。例如，血清circSETDB1在高級漿液性卵巢癌中上調(diào)，較高水平的circSETDB1與漿液性卵巢癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；原發(fā)化學(xué)耐藥患者的血清circSETDB1水平顯著增加，circSETDB1水平較高的患者的無進展生存期較短，因此血清circSETDB1可以作為一種新型的非侵入性生物標(biāo)志物[33]。circMUC16在上皮性卵巢癌患者血清中的表達增加，其表達與腫瘤的分級和分期有關(guān)，因此，circMUC16可以作為上皮性卵巢癌的潛在生物標(biāo)志物[34]。exo-hsa_circRNA_0056616的表達與肺腺癌的T期、M期和TNM分級之間存在顯著負相關(guān)，因此，exo-hsa_circRNA_0056616是有價值的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺腺癌的診斷學(xué)生物標(biāo)志物[35]。在多發(fā)性骨髓瘤患者中，hsa_circRNA_101237的表達升高，hsa_circRNA_101237可以用作多發(fā)性骨髓瘤新的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物以及潛在的治療靶標(biāo)[36]?？傊琧ircRNA在生物標(biāo)志物的開發(fā)中顯示出巨大的潛力，與線性RNA相比，具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的circRNA更穩(wěn)定并且具有較長的半衰期，因此更適用于生物標(biāo)志物的開發(fā)。雖然circRNA在檢驗診斷方面的應(yīng)用還處于初級階段，但是對大量臨床樣本的研究展現(xiàn)了其良好的臨床應(yīng)用價值，未來需要挖掘更多更有意義的circRNA，進一步評估其在臨床檢驗工作的實際作用。相信隨著新一代RNA測序技術(shù)的發(fā)展以及對更多臨床樣本的研究，circRNA會成為檢驗診斷和臨床治療的新模型。