李華坤 孫 朋 昌莉麗

徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州221006

杠板歸是蓼科蓼屬植物，又名蛇倒退、刺犁頭、刺蓼，具有抗炎、抗病毒、止咳祛痰、保肝、抗腫瘤、抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性、抑制乙酰膽堿酯酶活性等藥理作用，常用于瀉痢、疔瘡腫痛、蛇蟲咬傷等癥[1-2]。杠板歸資源豐富，生長范圍廣泛，抗大腸桿菌、沙門菌和多殺性巴氏桿菌，將其制備成復(fù)方中藥用于畜禽細菌性腹瀉是很好的研究方向，復(fù)方中藥可以減少抗生素殘留，對于保障食品安全和公共衛(wèi)生安全具有十分重要的意義。本試驗檢測杠板歸對多重耐藥大腸桿菌抑制效果以及杠板歸與抗菌藥聯(lián)用抑菌效果，以期為研制臨床上耐藥性疾病防治的新藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）藥物：杠板歸來源于廣東揭陽。頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢他啶、左氟沙星、鏈霉素、卡那霉素、萬古霉素、大觀霉素、阿米卡星、四環(huán)素、諾氟沙星、米諾環(huán)素、氧氟沙星、青霉素G、頭孢曲松、多粘菌素B、苯唑西林、卡那霉素、紅霉素、克林霉素，21 種藥物購自杭州濱和微生物試劑有限公司，空白紙片購自賽莫爾實驗用品城。

2）菌株：大腸桿菌來源于徐州房村養(yǎng)豬場腹瀉仔豬的小腸和糞便、無腹瀉癥狀仔豬糞便及家兔新鮮糞便。Ⅰ號菌株大腸桿菌毒力基因IRP2 菌株來自于患有大腸桿菌病腹瀉后死亡的仔豬小腸，Ⅱ號菌株大腸桿菌毒力基因IRP2 菌株來自于患有大腸桿菌病腹瀉后死亡的仔豬糞便，Ⅲ號菌株來自于房村無腹瀉癥狀的仔豬糞便，Ⅳ號菌株來自于家兔新鮮糞便。

3）儀器與試劑：天津市英博生化試劑有限公司普通營養(yǎng)瓊脂，杭州微生物試劑有限公司普通肉湯培養(yǎng)基，上海花潮電器有限公司UTP-313 電子天平，上海亞榮生化儀器廠RE-3000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海一恒科技有限公司LRH 生化培養(yǎng)箱，日本TOMY公司SX-500 高壓滅菌鍋。

1.2 方 法

1）中藥提取。杠板歸水浸液制備，稱取干燥杠板歸10、20 g 分別放入廣口瓶中，用蒸餾水浸泡，并保證藥物充分浸泡（浸泡24 h），用濾紙過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50 ℃制備藥物濃度約為10%和20%杠板歸溶液，將溶液冷藏備用。

2）藥敏片的制備。制備杠板歸藥片，取空白紙片各50 片放入2 個小玻璃瓶中，分別量取1 mL 10%和20%杠板歸溶液浸泡紙片，1 片空白紙片吸取20 μL 藥物，相當(dāng)于原藥2 mg/片和4 mg/片，浸泡2 h 后取出，干燥后冷凍保存。制備杠板歸聯(lián)合抗菌藥藥片，選擇21 種抗菌藥，其中部分藥物對革蘭氏陽性菌作用強、對革蘭氏陰性菌弱，如紅霉素、青霉素等作為對照。藥物規(guī)格10 片/瓶，每瓶中加入0.2 mL 10%杠板歸溶液浸泡紙片，浸泡2 h 后取出，干燥后冷凍保存。

3）菌液制備。挑取菌落分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)18 h 后，制備菌懸液，采用麥?zhǔn)媳葷岱ū葘岫纫恢?，菌液濃度?05CFU/mL。

4）采用紙片擴散法進行杠板歸、抗菌藥、杠板歸聯(lián)合抗菌藥對大腸桿菌藥敏試驗。配比4.2%的普通營養(yǎng)瓊脂，過濾分裝，121 ℃高壓滅菌后備用。用滅菌棉試子蘸取制備好的菌液，在管壁上旋轉(zhuǎn)擠壓幾次，去掉過多的菌液，將棉試子涂布到培養(yǎng)基的表面，每種菌株各接種15 個平皿。用滅菌尖頭鑷子取已備好的干燥藥紙片，同一平皿上藥片有杠板歸、抗菌藥、杠板歸抗菌藥。將藥敏片分別貼在各組培養(yǎng)基的表面，2 片之間的距離為1～2 cm，紙片距平皿邊緣約1.5 cm。將貼紙片的平板底部向上，在平板底部用標(biāo)簽標(biāo)出藥物名稱，置37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h 后分別測定抑菌圈的大小。

5）藥敏試驗判定標(biāo)準(zhǔn)。西藥判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國CLSI 標(biāo)準(zhǔn)（詳見表1），抑菌結(jié)果分為S 敏感、I 中介和R 耐藥。中藥判定標(biāo)準(zhǔn)抑菌圈直徑在15 mm 以上為高度敏感，10～15 mm 為中度敏感，10 mm 以下為低度敏感，無抑菌圈為不敏感。

2 結(jié)果與分析

2.1 20%杠板歸和10%杠板歸抗大腸桿菌藥敏試驗結(jié)果

20%杠板歸對4 種菌株平均抑菌圈均在15 mm 以上，為高度敏感；10%杠板歸對Ⅲ號大腸桿菌平均抑菌圈在15 mm 以上，為高度敏感（表2）。

2.2 抗菌藥抗大腸桿菌藥敏試驗結(jié)果

1）表3所示10 種抗菌藥物抗Ⅰ號菌株結(jié)果：多粘菌素B 敏感，頭孢噻肟中介，頭孢噻吩、左氟沙星、諾氟沙星、鏈霉素、卡那霉素、紅霉素、米諾環(huán)素、苯唑西林耐藥。

表1 21 種抗生素藥敏試驗判定標(biāo)準(zhǔn)

2）表4所示10 種抗菌藥物抗Ⅱ號菌株結(jié)果：丁胺卡那、妥布霉素敏感，頭孢曲松中介，卡那霉素、紅霉素、四環(huán)素、多粘菌素B、青霉素G、克林霉素、大觀霉素耐藥。

3）表5所示10 種抗菌藥物抗Ⅲ號菌株結(jié)果：丁胺卡那、頭孢呋辛、頭孢吡肟、頭孢他啶敏感，鏈霉素、頭孢曲松、氧氟沙星中介，卡那霉素、萬古霉素、青霉素G 耐藥。

2.3 抗菌藥與10%杠板歸合用抗大腸桿菌藥敏試驗結(jié)果

1）表3所示10 種聯(lián)合藥物抗Ⅰ號菌株結(jié)果：多粘菌素B、頭孢噻肟、頭孢噻吩、左氟沙星、諾氟沙星、鏈霉素、紅霉素、米諾環(huán)素、苯唑西林敏感，卡那霉素中介。

2）表4所示10 種聯(lián)合藥物抗Ⅱ號菌株結(jié)果：丁胺卡那、妥布霉素、頭孢曲松、卡那霉素、紅霉素、多粘菌素B、青霉素G、克林霉素、大觀霉素敏感，四環(huán)素中介。

3）表5所示10 種聯(lián)合藥物抗Ⅲ號菌株結(jié)果：丁胺卡那、頭孢呋辛、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢曲松、氧氟沙星、鏈霉素、萬古霉素、青霉素G 敏感，卡那霉素中介。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

1）Ⅰ號、Ⅱ號菌株對10 種抗菌藥物有不同程度耐藥性，將抗菌藥物與杠板歸合用后敏感度增加。普通致病性大腸桿菌、仔豬耐藥大腸桿菌毒力基因IRP2 對杠板歸都是高度敏感，20%杠板歸比10%杠板歸抗菌效果好。說明杠板歸對多重耐藥大腸桿菌菌株有明顯抑制效果，濃度增加藥效增強。

2）杠板歸與21 種藥物配合后有20 種藥物藥敏試驗抑菌圈明顯增大，與卡那霉素合用抑菌圈變化不顯著。杠板歸與20 種抗菌藥聯(lián)用起到協(xié)同作用，杠板歸抗菌活性強，可以代替抗菌藥單獨用于臨床上耐藥性仔豬大腸桿菌病的治療。

3.2 討 論

1）整個試驗過程中，杠板歸溶液的提取濃縮、藥片的干燥等都控制在50 ℃以下，杠板歸溶液對Ⅲ號大腸桿菌最低抑菌濃度為0.031 5 g/mL。扶亞祥等[3]用紙片法和試管法對杠板歸水溶液進行體外抗菌試驗，結(jié)果顯示杠板歸水提取液對大腸埃希菌最低抑菌濃度（MIC）為0.063 g/mL，可進一步研究溫度對杠板歸作用產(chǎn)生的影響。

表2 杠板歸對大腸桿菌體外抑菌效果

表3 10 種抗菌藥與10%杠板歸對Ⅰ號菌株藥敏試驗結(jié)果

2）目前從杠板歸中分離鑒定出的化學(xué)成分130 余種，黃酮類、醌類、苯丙素類、萜類、生物堿類、揮發(fā)性成分等。張榮林等[4]從杠板歸中分離到7 種黃酮類化合物。王定勇等[5]從中分離到槲皮素-3-O-a-D-葡萄糖苷、蒽醌類的大黃素。杠板歸中化學(xué)成分結(jié)構(gòu)類型多樣，國外的研究發(fā)現(xiàn)主要含有香豆素類衍生物[6]、三萜類化合物（如諾米林酸類衍生物）[7]、蔗糖酯衍生物（如蔗糖苯基丙酸酯）[8-9]以及新黃酮類聚合物。溫度對杠板歸作用產(chǎn)生影響，杠板歸的抗菌活性成分有待進一步研究，除此外還可以研究水質(zhì)、提取方式、種植環(huán)境、加工工藝等對杠板歸的作用影響。

3）杠板歸溶液制備藥敏片，將藥片冷凍保存1年仍具有較強的抗菌活性，杠板歸在臨床上可以制備成多種制劑用于防治畜禽疾病，如顆粒劑、凍干粉劑、膠囊劑等，制備的藥物成品可以低溫冷凍保存使用。

表4 10 種抗菌藥與10%杠板歸對Ⅱ號菌株藥敏試驗結(jié)果

表5 10 種抗菌藥與10%杠板歸對Ⅲ號菌株藥敏試驗結(jié)果