史 梅

新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，烏魯木齊830000

恩諾沙星（enrofloxaein，ENR）是一種氟喹諾酮類藥物，是家禽養(yǎng)殖中廣泛使用的抗生素，具有抗菌譜廣、殺菌活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛使用，對(duì)預(yù)防和治療動(dòng)物細(xì)菌性疾病和支原體感染方面具有較高療效[1-2]。然而部分企業(yè)和養(yǎng)殖戶為追求畜禽快速增長(zhǎng)及預(yù)防其生病而忽略安全添加劑量，無視休藥期等規(guī)范用藥而造成抗生素濫用。忽視用藥規(guī)律而長(zhǎng)期濫用抗生素會(huì)導(dǎo)致耐藥性[3-6]，最終影響畜禽產(chǎn)業(yè)發(fā)展和人類的健康。因此，在畜禽產(chǎn)品中檢測(cè)氟喹諾酮類藥物含量非常有必要。在檢測(cè)分析中，由于受檢測(cè)儀器、檢測(cè)方法及試驗(yàn)誤差的影響，檢測(cè)值往往低于真實(shí)值。如何判定檢測(cè)結(jié)果真實(shí)有效，不確定度是一個(gè)重要的參考指標(biāo)。不確定度可反映測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[7]，其受諸多因素的影響。然而，1 個(gè)試驗(yàn)的不確定度評(píng)價(jià)往往較為困難，需要考慮諸多因素和試驗(yàn)環(huán)節(jié)。本文通過參照中國(guó)農(nóng)科院建立的評(píng)價(jià)《雞蛋和雞肉中氟喹諾酮類藥物及金剛烷胺殘留測(cè)定操作細(xì)則》中恩諾沙星的不確定度的方法，及其他相關(guān)技術(shù)文獻(xiàn)和指南[8-9]，評(píng)定液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LCMS）測(cè)定雞肉中恩諾沙星含量的不確定度，以期為氟喹諾酮類藥物檢測(cè)方法的改進(jìn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：Waters Xevo TQ-S，美國(guó)沃特世公司，METTLER TOLEDO MS105DU 萬分之一電子分析天平，METTLER TOLEDO 公司生產(chǎn)；Eppendorf 移液器（20、100、1 000 μL），德國(guó)Eppendorf 公司；C18 固相萃取柱（100 mg/3 mL），安捷倫公司生產(chǎn)。恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)50128，德國(guó)Dr 公司，純度98.5%），內(nèi)標(biāo)為恩諾沙星D5 標(biāo)準(zhǔn)品，乙腈、正己烷、乙酸、甲酸均為色譜純，氫氧化鈉為分析純，水為一級(jí)水。

1.2 方 法

1）恩諾沙星測(cè)量方法。

①標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)工作液的配置。精密稱取恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇定容至10 mL 棕色容量瓶中，制得質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃冰箱保存，同位素內(nèi)標(biāo)配制按如上操作。用移液器將標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，最終用流動(dòng)相定容上機(jī)工作液恩諾沙星和內(nèi)標(biāo)均為20 ng/mL。

②樣品前處理。取2.00 g 雞肉樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 1%乙酸乙腈，渦旋提取2 min，10 000 /min 離心5 min，上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，重復(fù)提取1 次，合并上清液，50 ℃氮吹至干，加磷酸鹽2 mL 溶解殘?jiān)?，C18 固相萃取柱凈化，先用2 mL 乙腈和2 mL 磷酸鹽緩沖液活化平衡，將待凈化液過柱，用2 mL 水淋洗，真空抽干，用1 mL 0.1%甲酸乙腈水溶液洗脫，真空抽干，洗脫液過0.22 μm 濾膜后上機(jī)測(cè)定。

③色譜條件。

A.色譜柱：BEH C18 1.7 μm ×2.10 mm×50 mm。

B.流速：0.3 mL/min。

C.進(jìn)樣體積：2 μL。

D.流動(dòng)相：0.1%甲酸乙腈溶液。

④質(zhì)譜條件。

A.離子源：電噴霧離子源（ESI+）。

B.掃描方式：多反映離子監(jiān)測(cè)（MRM）。

C.離子源溫度：600 ℃。

D.離子源噴霧電壓：5 500 V。

⑤結(jié)果計(jì)算。

恩諾沙星用恩諾沙星-D5 校準(zhǔn)，單點(diǎn)校準(zhǔn)，按如下公式計(jì)算恩諾沙星含量：

式中：A——待測(cè)樣品中恩諾沙星的面積；

A’is——標(biāo)準(zhǔn)品中恩諾沙星內(nèi)標(biāo)的面積；

As——標(biāo)準(zhǔn)品中恩諾沙星的面積；

Ais——待測(cè)樣品中恩諾沙星內(nèi)標(biāo)的面積；

Cs——標(biāo)準(zhǔn)品中恩諾沙星的質(zhì)量濃度（ng/mL）；

Cis——樣品中恩諾沙星內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度（ng/mL）；

C’is——標(biāo)準(zhǔn)品中恩諾沙星內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度（ng/mL）；

V——溶解殘余物所用試樣溶液體積；

m——供試試樣的質(zhì)量（g）。

2）測(cè)量不確定度分析。在本試驗(yàn)的不確定度分析中，首先考慮多次測(cè)量引入的不確定度，其次考慮每一步試驗(yàn)操作中可能影響結(jié)果的步驟操作產(chǎn)生的不確定度，即樣品稱量、標(biāo)準(zhǔn)品配制、定容體積、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積和恩諾沙星內(nèi)標(biāo)峰面積這些因素引入的測(cè)量結(jié)果的不確定[10]。

①測(cè)量重復(fù)性的不確定度的確定。為了得到一個(gè)可靠性較高的測(cè)量重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差，在本次試驗(yàn)測(cè)量中，平行測(cè)量6 個(gè)試驗(yàn)樣品，測(cè)量值見表1。

6 個(gè)樣品恩諾沙星含量的平均值為9.88 μg/kg，按貝塞爾公式計(jì)算測(cè)量重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)。

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為：

在以6 個(gè)樣品的平均值報(bào)告測(cè)量結(jié)果時(shí)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按如下公式計(jì)算：

此分量已經(jīng)合并了試樣不均勻、環(huán)境條件的波動(dòng)以及操作的差異等隨機(jī)因素的影響。因此，在隨后進(jìn)行的不確定度分量評(píng)定時(shí)就不需要再考慮這些隨機(jī)因素的影響。

②試樣質(zhì)量的不確定度的確定。天平校準(zhǔn)證書說明校準(zhǔn)的擴(kuò)展不確定度為0.05 mg，包含因子k=2，因此其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.025 mg。試樣質(zhì)量為2 g，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度應(yīng)為urel（m）=1.25×10-5。

③定容體積的不確定度的確定。檢定規(guī)程JJG196-1990《常用玻璃量器》規(guī)定，10 mL A 級(jí)容量瓶的允許誤差為0.02 mL，假設(shè)為三角形分布，其相對(duì)不確定度應(yīng)為：

④恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度的確定。恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品純度為98.5%±1.5%，由于沒有不確定度的其他信息，假設(shè)是均勻分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（P）的值為：

⑤恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積和恩諾沙星內(nèi)標(biāo)峰面積測(cè)量引入的不確定度分量的確定。為確定恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差，重復(fù)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品濃度和內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為20 ng/mL 的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品6 次，得到峰面積見表2。

單次測(cè)量恩諾沙星峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差按如下公式計(jì)算：

表1 6 個(gè)試驗(yàn)樣品的恩諾沙星含量

表2 6 次恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積

取6 次平均值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

按相同公式計(jì)算得到內(nèi)標(biāo)面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差：

3）不確定度的合成。

試樣中恩諾沙星X 含量的合成不確定度按下式計(jì)算：

取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度：U（X）=ku（X）=2×0.123=0.25 μg/kg

相對(duì)擴(kuò)展不確定度：Urel（X）=0.25÷9.88×100%=2.5%

2 討 論

目前測(cè)量不確定度的評(píng)定方法有2 種，A 類方法和B 類方法，A 類方法即測(cè)量不確定度的A 類評(píng)價(jià)，用試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差或它的倍數(shù)來表示，只要某個(gè)是可以重復(fù)測(cè)量的，在評(píng)價(jià)其不確定度時(shí)，首先應(yīng)當(dāng)考慮重復(fù)測(cè)量引入的不確定度。本試驗(yàn)測(cè)量6 個(gè)平行樣本，以此獲得重復(fù)測(cè)量引入的不確定度。B 類方法是B 類評(píng)定，是用不同于測(cè)量不確定度A 類評(píng)定的方法對(duì)測(cè)量不確定度分量進(jìn)行的評(píng)定[7,11]，是不具有統(tǒng)計(jì)規(guī)律引入的不確定度分析，即對(duì)試驗(yàn)過程中使用的天平、量具等設(shè)備引入的不確定度。在本試驗(yàn)中，考慮到了稱樣使用的天平、定容使用的容量瓶，根據(jù)檢定證書上的擴(kuò)展不確定度，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度。按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的條件測(cè)定雞肉中恩諾沙星殘留量，參考中國(guó)農(nóng)科院建立方法《雞蛋和雞肉中氟喹諾酮類藥物及金剛烷胺殘留測(cè)定操作細(xì)則》，本試驗(yàn)測(cè)定6 份樣品取平均值報(bào)告結(jié)果，其結(jié)果和擴(kuò)展不確定度為9.88±0.25 μg/kg，包含因子k=2，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為2.5%。

3 結(jié) 論

利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LCMS）測(cè)定雞肉中恩諾沙星含量時(shí)，評(píng)價(jià)不確定度應(yīng)引入多次重復(fù)測(cè)量、天平稱量、標(biāo)準(zhǔn)品配制、定容體積等因素。