李穎暢 杜鳳霞 張 笑 劉雪飛 蔡友瓊 楊賢慶 勵建榮*

（1 渤海大學食品科學與工程學院 生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧錦州121013 2 中國水產科學研究院東海水產研究所 上海200090 3 中國水產科學研究院南海水產研究所 廣州540641）

近年來，從魷魚、魷魚制品以及其它水產品中檢測出甲醛（formaldehyde，FA）[1]，引起人們的關注，認為水產品自身能夠產生甲醛[2]。 水產品在高溫作用下體內的氧化三甲胺 （trimethylamine oxide，TMAO）熱分解為三甲胺（trimethylamine，TMA）、二 甲 胺（dimethylamine，DMA）和 甲 醛[3-4]。Lin 等[5]研究發(fā)現200 ℃條件下加熱反應1 h 后魷魚肌肉組織中大部分氧化三甲胺發(fā)生熱分解反應。 生物體內的還原性的小分子物質對氧化三甲胺分解形成甲醛具有催化作用。 Ferris 等[6]證實了氧化三甲胺在Fe2+催化下能夠生成甲醛和二甲胺。 Vaisey[7]研究證明了半胱氨酸（Cys）與Fe2+或Cys 與血紅蛋白能催化氧化三甲胺分解產生三甲胺、少量二甲胺和甲醛。 Spinelli 等[8]發(fā)現抗壞血酸和Fe2＋等對魷魚體內氧化三胺熱分解有促進作用。李豐等[9]研究發(fā)現乳糖可以促進模擬體系中氧化三甲胺的分解。 陳帥等[10]認為半乳糖對氧化三甲胺的熱分解有促進作用。 氧化三甲胺熱分解產生甲醛嚴重制約魷魚加工產業(yè)的發(fā)展， 采取有效措施抑制甲醛的產生， 是一項重要的研究任務。Zhu 等[11]和勵建榮等[12]研究表明秘魯魷魚熱加工過程中有甲醛和自由基形成。朱軍莉等[13-14]研究發(fā)現添加檸檬酸和氯化鈣會顯著降低（P＜0.05）魷魚提取物中氧化三甲胺的熱分解， 同時檸檬酸根離子對魷魚提取物中DMA 和FA 的形成也有負面影響。 藍莓多酚類化合物是藍莓葉中的一種重要的生物活性成分，具有抗氧化、抗癌、保護視力、抑制微生物生長、 降血脂、 降血糖等多種功能特性[15]。 藍莓葉多酚對魷魚中氧化三甲胺熱分解的影響鮮見報道。本文以魷魚上清液為對象，分析藍莓葉多酚對魷魚上清液中氧化三甲胺高溫分解的影響， 以及對秘魯魷魚高溫加熱過程中甲醛的抑制作用，為尋找天然、高效的甲醛抑制劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

藍莓葉， 沈陽農業(yè)科學發(fā)展研究院； 秘魯魷魚，錦州市林西路水產市場。

三羥甲基氨基甲烷（Tris），天津市百世化工有限公司；甲醛溶液，鄒平恒坤化工有限公司；石油醚，鄭州易興化工產品銷售有限公司；2，4-二硝基苯肼，上海邦成化工有限公司；無水乙醇，揚州德諾化工有限公司；氫氧化鈉，山西天河化工有限公司；苦味酸，國藥集團化學試劑有限公司；三氯化鈦（TiC13），廣州順平生物科技有限公司；對甲苯磺酞氯，吳江市博霖實業(yè)有限公司；乙酸，上海邁瑞爾化學技術有限公司；甲苯，天津市密歐化學試劑有限公司；2-苯叔丁基硝酮（PBN），北京百靈威生物科技有限公司。以上試劑均為分析純級。甲醛標準溶液、氧化三甲胺標準品，國家環(huán)境保護總局標準樣品研究所； 甲醇（色譜純）， TEDIA 公司；AB-8 大孔樹脂，天津市津達正通環(huán)?？萍加邢薰?。

1.2 設備與儀器

CF1524R 冷凍高速離心機， 美國賽洛捷克（scilogex）公司； AD500S-P 高速分散均質機，蘇州江東精密儀器有限公司；JR10-300 絞肉機，浙江蘇泊爾股份有限公司；166457 旋轉蒸發(fā)儀，北京鼎盛兄弟科技有限公司；BSH-3A 循環(huán)水真空泵，信凱（北京）科技有限公司；Series Ⅱ型高壓輸液泵、恒流泵，北京中教金源科技有限公司；SDY-2 恒溫水浴鍋，北京賽歐華創(chuàng)科技有限公司；Free-Zone 2.5 L 臺式凍干機， 美國Labconco 公司；HPLC1200 高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；UV1700PC 紫外-可見分光光度計， 上海奧析科學儀器有限公司；PX2202ZH 電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；安捷倫7890 氣相色譜儀， 美國安捷倫科技有限公司；SB25-12DT 超聲波，寧波SCIENTZ/新芝公司；電子自旋共振儀，德國Magnettech 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍莓葉多酚的制備 參照李穎暢等[16]的方法。

1.3.2 魷魚上清液的制備 10 g 秘魯魷魚，去皮、骨、內臟，絞碎。 取碎魷魚肉，按1∶2（g/mL）與20 mmol/L Tris-乙酸緩沖液（pH 7.0）混合，勻漿，冰浴條件下超聲30 min， 離心15 min （12 000 r/min），取上清液，4 ℃冷藏備用。

1.3.3 藍莓葉多酚濃度對魷魚上清液TMAO 高溫熱分解的影響 分別取質量濃度為0，1，5，10，50，100，150，200 mg/L 的藍莓葉多酚溶液2 mL，與2 mL 魷魚上清液混合，反應溫度90 ℃，在反應時間15 min 條件下反應。 測定魷魚上清液中氧化三甲胺、三甲胺、二甲胺和甲醛含量的變化。

1.3.4 加熱時間對魷魚上清液TMAO 高溫熱分解的影響 取0.05 g/L 藍莓葉多酚溶液2 mL 與2 mL 魷魚上清液混合，在反應溫度90 ℃，加熱時間分別為0，15，30，45，60，75，90 min 條件下反應。測定魷魚上清液中氧化三甲胺、三甲胺、二甲胺和甲醛含量的變化。

1.3.5 反應溫度對魷魚上清液TMAO 高溫熱分解的影響 取0.05 g/L 藍莓葉多酚溶液2 mL 與2 mL 魷魚上清液混合，在反應時間15 min，反應溫度分別為80，90，100，110，120，130 ℃。 測定魷魚上清液中氧化三甲胺、三甲胺、二甲胺和甲醛含量變化。

1.3.6 藍莓葉多酚抑制甲醛產生的自由基機制在0.25 mL 魷魚上清中分別添加不同質量濃度（0，0.005，0.05，0.1 g/L）的藍莓葉多酚溶液0.25 mL， 添加2-苯叔丁基硝酮后在100 ℃加熱15 min，以蒸餾水代替藍莓葉多酚作對照，檢測自由基的變化。

1.3.7 甲醛、二甲胺、三甲胺和氧化三甲胺的檢測方法 甲醛含量測定參考Li 等[17]的方法；二甲胺含量測定參考賈佳等[18]的方法；三甲胺含量測定參考朱軍莉等[19]的方法；氧化三甲胺含量測定：量取4 mL 反應液，加入0.5 mL 1% TiCl3溶液，80 ℃水浴90 s，流水冷卻，測定步驟與三甲胺的相同。

1.3.8 自由基的檢測方法 根據賈佳等[20]的方法。

1.4 數據處理

所有試驗每組取3 個平行，結果為均值±標準偏差。 采用SPSS19.0 的ANOVA 進行方差分析，P＜0.05 為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同濃度藍莓葉多酚對魷魚上清液高溫熱分解的影響

Zhu 等[11]研究發(fā)現氧化三甲胺（TMAO）在高溫熱分解過程中能夠產生二甲胺和甲醛。 由圖1可知， 未加藍莓葉多酚的魷魚上清液中甲醛含量是最高的。隨著藍莓葉多酚濃度的增加，上清液中FA、DMA 和TMA 的含量不斷減少， 分別從1.53，49.49，46.07 mg/L 降 至0.14，41.42 mg/L 和33.29 mg/L；而TMAO 含量的變化卻相反，隨藍莓葉多酚濃度的增加，TMAO 含量增加，分解量減少，其含量從2027.47 mg/L 升至2 533.90 mg/L。 藍莓葉多酚質量濃度在50～100 mg/L 之間，FA 的生成量和TMAO 的減少量無顯著性差異（P＞0.05），藍莓葉多酚質量濃度為50 mg/L 時， 甲醛的減少量和TMAO 的生成量趨于平衡。 藍莓葉多酚溶液對魷魚上清液TMAO 的熱分解反應有抑制作用， 可顯著降低魷魚上清液中甲醛含量， 當藍莓葉多酚質量濃度≥50 mg/L 時抑制效果較好。 Garro Galvez等[21]報道沒食子酸能夠和甲醛反應，與本研究結果一致。 Ferris 等[22]研究發(fā)現TMAO 在Fe2+的催化下通過（CH3）3N 自由基生成FA、DMA 和TMA。藍莓葉多酚能夠抑制TMAO 的分解和FA 的生成，其原因可能是藍莓葉多酚中的單寧酸類物質與Fe2+生成某種物質抑制了自由基生成，從而導致上清液中TMAO 的分解受到抑制， 或者藍莓葉多酚可能與FA 發(fā)生酚醛反應使FA 的最終含量減少，達到抑制效果。

圖1 藍莓葉多酚質量濃度對魷魚上清液氧化三甲胺高溫熱分解的影響Fig.1 Effects of polyphenols concentration of blueberry leaves on the TMAO thermal decomposition in squid supernatant

2.2 加熱時間對魷魚上清液高溫熱分解的影響

不同加熱時間下藍莓葉多酚對魷魚上清液中TMAO 熱分解的影響如圖2 所示。Zhu 等[11]報道隨著加熱時間的增加，TMAO 熱分解成甲醛和二甲胺加速。 對照組和藍莓葉多酚處理組TMAO 含量降低，90 min 內對照組魷魚上清液中TMAO 含量從2 327.03 mg/L 減至1 230.21 mg/L，氧化三甲胺含量減少了47.13%。 與對照組相比，添加0.05 g/L藍莓葉多酚的魷魚上清液90 min 內TMAO 的含量從2 336.04 mg/L 減至2 106.46 mg/L，氧化三甲胺含量減少了9.83%，TMAO 含量的減少被顯著抑制。 對照組魷魚上清液中FA、DMA 和TMA 的含量隨著加熱時間的增加而增加， 分別從0.19，47.10 mg/L 和18.35 mg/L 升 至11.49，104.50 mg/L和51.03 mg/L。 與對照組相比，藍莓葉多酚組魷魚上清液中FA、DMA 和TMA 含量的增加被抑制，加熱90 min 后FA 含量僅0.86 mg/L， 說明藍莓葉多酚使魷魚上清液中甲醛含量降低， 其原因是藍莓葉多酚與FA 發(fā)生酚醛縮合反應，導致FA 含量減少。 藍莓葉多酚有可能抑制魷魚上清液中TMAO 高溫熱分解， 導致DMA、TMA 和FA 含量降低。

2.3 反應溫度對魷魚上清液高溫熱分解的影響

圖2 不同加熱時間的藍莓葉多酚對魷魚上清液中TMAO 熱分解的影響Fig.2 Effects of polyphenols of blueberry leaves on the TMAO thermal decomposition in squid supernatant at different time

不同加熱溫度下藍莓葉多酚對TMAO 熱分解的影響如圖3 所示。隨著加熱溫度的增加，對照組和藍莓葉多酚處理組氧化三甲胺含量均降低，溫度越高降低越顯著， 而對照組魷魚上清液中氧化三甲胺含量顯著低于（P＜0.05）藍莓葉多酚組魷魚上清液中氧化三甲胺含量， 即藍莓葉多酚使氧化三甲胺熱分解程度降低。隨著加熱溫度的升高，對照組魷魚上清液中氧化三甲胺含量從2 179.871 mg/L 降至1 519.392 mg/L，氧化三甲胺含量下降了30.29%。 藍莓葉多酚處理的魷魚上清液中TMAO含量從2 356.466 mg/L 降至2 048.813 mg/L，氧化三甲胺含量下降了13.06%。 隨著加熱溫度的升高，對照組甲醛含量顯著（P＜0.05）增加，而藍莓葉多酚處理組甲醛含量增加緩慢。 隨著加熱溫度的升高， 對照組魷魚上清液中甲醛含量從0.663 mg/L 增至6.541 mg/L， 對照組甲醛含量增加了9.77倍。 藍莓葉多酚組魷魚上清液FA 的最高含量達0.560 mg/L，說明加熱溫度越高，產生的甲醛越多，在藍莓葉多酚的作用下， 不同加熱溫度的魷魚上清液中甲醛含量降低。 對照組和藍莓葉多酚處理組二甲胺和三甲胺含量隨著加熱溫度的升高也顯著（P＜0.05）上升，而藍莓葉多酚處理組二甲胺和三甲胺含量顯著（P＜0.05）低于對照組。 對照組的三甲胺和二甲胺最高含量分別為57.714，58.597 mg/L。 藍莓葉多酚處理組三甲胺和二甲胺最高含量分別為49.465，47.527 mg/L。 添加藍莓葉多酚后，三甲胺含量降低了14.29%，二甲胺含量降低了18.89%。 在藍莓葉多酚的作用下，魷魚上清液中氧化三甲胺高溫熱分解被抑制， 導致上清液中三甲胺和二甲胺含量下降。

圖3 不同加熱溫度的藍莓葉多酚對魷魚上清液中TMAO 熱分解的影響Fig.3 Effects of polyphenols of blueberry leaves on the TMAO thermal decomposition in squid supernatant at different temperature

2.4 不同pH 值藍莓葉多酚溶液對魷魚上清液高溫TMAO 熱分解的影響

不同pH 值藍莓葉多酚溶液對魷魚上清液中TMAO 熱分解的影響如圖4 所示。pH＜7 時對照組和藍莓葉多酚組魷魚上清液中TMAO 含量隨pH值的升高而降低， pH＞7 時對照組和藍莓葉多酚組魷魚上清液中TMAO 含量升高。與對照組相比，用藍莓葉多酚處理的魷魚上清液TMAO 含量顯著（P＜0.05）高于對照組魷魚上清液中TMAO 含量，說明藍莓葉多酚對魷魚上清液中TMAO 高溫熱分解有抑制作用。pH＜7 時對照組和藍莓葉多酚組魷魚上清液中FA、DMA 和TMA 含量隨pH 值的升高而升高；pH＞7 時對照組和藍莓葉多酚組魷魚上清液中FA、DMA 和TMA 含量降低。 與對照組相比， 藍莓葉多酚處理組的魷魚上清液中FA 含量顯著（P＜0.05）降低。 TMAO 高溫熱分解與pH 值有關，pH7.0 時TMAO 熱分解的量最少，產生甲醛的量也最少。

圖4 不同pH 值的藍莓葉多酚對魷魚上清液中TMAO 熱分解的影響Fig.4 Effects of polyphenols of blueberry leaves on the TMAO thermal decomposition in squid supernatant at different pH

2.5 藍莓葉多酚對魷魚上清液TMAO 熱分解產生自由基的影響

圖5 不同濃度藍莓葉多酚對魷魚上清液中自由基的影響Fig.5 Effects of different concentration polyphenols of blueberry leaves on the generation of free radical in squid supernatant

以PBN 為自由基捕獲劑，利用ESR 技術檢測不同濃度藍莓葉多酚與魷魚上清液反應樣品中的自由基。 如圖5 所示， 在磁場3 460.00～3 560.00 G，對照組的魷魚上清液經高溫處理產生明顯的六重峰自由基信號，在添加質量濃度為0.005 g/L 和0.05 g/L 的藍莓葉多酚的魷魚上清液中也出現明顯的六重峰自由基信號， 而自由基信號強度要比對照組弱。勵建榮等[12]和李穎暢等[23]在魷魚上清液中也捕捉到相同的自由基信號， 并發(fā)現魷魚中甲醛的產生與自由基存在密切的關系。 從圖5 可以看出，隨著藍莓葉多酚濃度的增加，魷魚上清液中自由基信號強度逐漸減弱， 當藍莓葉多酚質量濃度達到0.1 g/L 時，魷魚上清液中的自由基信號為基線雜峰。 藍莓葉多酚對自由基信號強度的影響與藍莓葉多酚抑制甲醛的產生是一致的。 由此可知， 藍莓葉多酚對魷魚上清液高溫熱分解途徑的抑制作用， 可能與藍莓葉多酚能夠清除魷魚上清液中自由基有關。

3 結論

1）不同濃度的藍莓葉多酚抑制魷魚上清液中氧化三甲胺的熱分解，使魷魚上清液中三甲胺、二甲胺和甲醛含量降低，藍莓葉多酚濃度越大，抑制效果越顯著。 加熱時間對氧化三甲胺熱分解影響顯著。 不同加熱時間的藍莓葉多酚處理組的氧化三胺含量高于對照組，甲醛、二甲胺和三甲胺含量低于對照組。 加熱溫度對魷魚上清液中氧化三胺熱分解影響極顯著，當溫度90～130 ℃時氧化三甲胺熱分解增強， 產生大量三甲胺、 二甲胺和甲醛。 藍莓葉多酚可抑制不同加熱溫度下氧化三甲胺的分解，三甲胺、二甲胺和甲醛含量顯著低于對照組。

2）魷魚上清液加熱過程中產生自由基。加入藍莓葉多酚后， 魷魚上清液中自由基信號強度減弱，藍莓葉多酚濃度越高，魷魚上清液中自由基信號強度越弱。