萬紅芳 汪立平* 趙 勇 李 立
(1 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海201306 2 食品熱加工工程技術(shù)研究中心 上海201306 3 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室 上海201306)
夾江腐乳是四川省的名優(yōu)特色腐乳, 產(chǎn)于樂山夾江縣,已有150 多年的生產(chǎn)歷史[1]。 它以黃豆為原料,經(jīng)過浸泡、磨細(xì)、制坯、培菌后,加入多種輔料并裝壇密封發(fā)酵而成。因其配方獨(dú)特,滋味濃郁,營養(yǎng)豐富,食用后余香不絕,故頗受當(dāng)?shù)叵M(fèi)者及外地游客的喜愛。 腐乳是我國傳統(tǒng)大豆發(fā)酵制品,具有濃郁的民族特色,有“東方奶酪”的美稱。腐乳的發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的生物化學(xué)過程,其中微生物的種類和數(shù)目對(duì)其品質(zhì)起著決定性的作用[2]。
長期以來,研究者們通過純培養(yǎng)的方法,從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離鑒定多種微生物, 然而這種方法只適用于可培養(yǎng)的微生物, 其含量占環(huán)境微生物的極小部分(<1%)[3]。 近年來,變性梯度凝膠電泳(Denatured gradient gel electrophoresis, DGGE)等分子生物學(xué)方法, 被廣泛應(yīng)用于食品中微生物的檢測(cè)、鑒定和群落結(jié)構(gòu)的研究[4-5]。 然而,這些方法既耗時(shí)又昂貴, 而且難以檢測(cè)低豐度的微生物類群, 在微生物群落和多樣性分析方面仍具有較大的局限性[6]。 高通量測(cè)序(High-Throughput Sequencing,HTS),是最近幾年新興發(fā)展的生物學(xué)技術(shù),能一次測(cè)序數(shù)百萬條DNA 分子,具有比以往方法更高的分辨率,能準(zhǔn)確、快速揭示樣本中的微生物多樣性及其群落組成[7]。 目前,研究人員通過高通量測(cè)序分析多種發(fā)酵食品中的微生物, 如泡菜[7]、榨菜[8]、豆醬[9]和豆豉[10]等,發(fā)現(xiàn)了更加豐富的微生物類群, 說明該技術(shù)在食品微生物快速檢測(cè)方面具有廣闊前景。
作為一種極具地域特色的自然發(fā)酵食品,夾江腐乳中的微生物均來自于自然環(huán)境。 由于目前對(duì)其中的微生物群落組成尚不清楚, 因此可能會(huì)出現(xiàn)一些質(zhì)量問題和安全隱患。 再加上近些年來低鹽腐乳的研制與開發(fā),使得這些問題格外突出。本試驗(yàn)通過高通量測(cè)序結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法,對(duì)比分析2 種類型的夾江腐乳——香辣腐乳和白菜腐乳(以腌制白菜葉包裹腐乳坯)中的微生物,旨在填補(bǔ)辣味腐乳和花色腐乳中微生物的研究空白, 為深度挖掘地域性發(fā)酵食品中的微生物資源提供依據(jù), 同時(shí)也為夾江腐乳質(zhì)量安全方面的研究提供參考依據(jù)。
市購2 種夾江腐乳樣品——香辣腐乳和白菜腐乳,產(chǎn)自四川省夾江縣清江釀造廠。兩種樣品出廠日期均為2018年1月14日, 開封取樣日期均為2018年1月17日。
在無菌條件下打開樣品包裝, 從腐乳罐中心部位依次取香辣腐乳25 g(其中腐乳塊24 g,湯汁1 mL),白菜腐乳25 g(其中白菜12 g,腐乳塊12 g,湯汁1 mL)。 每種樣品取樣2 份,1 份放入無菌均質(zhì)袋中,加入225 mL 無菌生理鹽水,用均質(zhì)機(jī)均質(zhì);另1 份放入無菌管中,置-20 ℃冷凍保藏備用(用于提取微生物總DNA)。
平板計(jì)數(shù)瓊脂 (PCA)(用于細(xì)菌總數(shù)和芽孢桿菌數(shù)目的測(cè)定)、孟加拉紅瓊脂(用于霉菌和酵母菌數(shù)目的測(cè)定)、MRS 瓊脂(用于乳酸菌數(shù)目的測(cè)定),上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒、 真菌基因組DNA 抽提試劑盒、瓊脂糖、TAE、Tap PCR Master Mix、引物、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒, 上海生工生物生物工程有限公司;AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒,AXYGEN公司。
SW-CJ-1F 無菌操作臺(tái), 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;JX-05 拍擊式均質(zhì)機(jī),上海松茂生物科技有限公司;HH-1 恒溫水浴鍋,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;GNP-9270 隔水式恒溫培養(yǎng)箱, 南京先璽儀器設(shè)備有限公司;LDZX-50KBX 立體式滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;H1650-W 高速離心機(jī),長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;DYY-6C 電泳儀,北京市六一儀器廠;Tocan240 凝膠成像儀, 美國Bio-rad 公司;GeneAmpR9700 型PCR 儀, 美國ABI 公司。
通過均質(zhì)機(jī)將2 種腐乳樣品充分拍打均勻后, 立即放入無菌操作臺(tái)中進(jìn)行系列稀釋(10-1~10-7),然后分別取各梯度稀釋液1 mL 于無菌平皿中,立即傾倒已融化并冷卻至50 ℃的培養(yǎng)基(PCA培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、MRS 培養(yǎng)基),搖勻后制成瓊脂平板。 將剩余的稀釋液放入80 ℃的恒溫水浴鍋中處理10 min, 然后按照相同的方法制成瓊脂平板(PCA 培養(yǎng)基)。同一個(gè)稀釋度做3 次重復(fù),將制成的PCA 和MRS 瓊脂平板分別在37 ℃下恒溫培養(yǎng)2 d 和3 d,孟加拉紅瓊脂平板在28 ℃下培養(yǎng)5 d 后,分別對(duì)菌落計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)[11-12]。
采用DNA 提取試劑盒抽提2 種腐乳樣品中的基因組DNA(具體操作見試劑盒使用說明書),用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。針對(duì)香辣腐乳和白菜腐乳的DNA, 首先利用引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì) 細(xì) 菌16S rRNA V3-V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 同時(shí)利用引物SSV0817F(5′-TTAGCATGGAATAATRRA ATAGGA-3′)和1196R (5′-TCTGGACCTGGTGAGTT TCC-3′)對(duì)真菌18S rRNA V5-V7 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 對(duì)于每個(gè)樣本,20 μL PCR 反應(yīng)體系為:4 μL 5×FastPfu Buffer,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.4 μL FastPfu 聚合酶,0.2 μL BSA, 模板DNA 10 ng,正、反向引物(5 μmol/L)各0.8 μL,補(bǔ)ddH2O 至20 μL。 每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù),隨后將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),利用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR 產(chǎn)物。具體PCR 擴(kuò)增程序如下:①95 ℃預(yù)變性3 min;②循環(huán)數(shù)(細(xì)菌27次, 真菌35 次)×(95℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s);③72 ℃延伸10 min。
Illumina Miseq 測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。
1)序列處理與優(yōu)化 利用Trimmomatic 軟件對(duì)原始序列修剪和過濾[13],去除含N 堿基的序列,每個(gè)序列的最小質(zhì)量值設(shè)置為20。 利用Flash 軟件將雙端序列拼接成1 條序列, 拼接序列的重疊區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2。根據(jù)序列首尾兩端的barcode 和引物區(qū)分樣品, 并調(diào)整序列方向,barcode 允許的錯(cuò)配數(shù)為0,最大引物錯(cuò)配數(shù)為2。
2)物種注釋 利用Usearch (version 7.0)軟件平臺(tái), 按照97%的相似性對(duì)優(yōu)化后的序列進(jìn)行OTU 聚類,在聚類過程中去除嵌合體,得到OTU的代表序列。 基于QIIME 軟件平臺(tái), 采用RDP classifier 貝葉斯算法對(duì)OTU 代表序列分類學(xué)分析[14], 分別在各個(gè)分類學(xué)水平: 門 (phylum),綱(class), 目(order), 科(family), 屬(genus), 種(species)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。 對(duì)比數(shù)據(jù)庫是Silva(Release128 http://www.arbsilva.de)數(shù) 據(jù)庫,置信度閾值為0.7。
3)多樣性指數(shù)分析 計(jì)算菌群豐度的指數(shù)有Chao 指數(shù)和Ace 指數(shù);計(jì)算菌群多樣性的指數(shù)有Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù); 測(cè)序深度指數(shù)為Coverage 指數(shù)(http://www.mothur.org/wiki/)。
4)物種分析 對(duì)含量在1%以上的OTUs,利用R 語言vegan 包在目水平上制作聚類熱圖;利用FastTree 軟件 (version 2.1.3 http://www.microbe- sonline.org/fasttree/)在屬水平上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹;利用origin 8.6 軟件對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行分析并制圖。
利用PCA 培養(yǎng)基、MRS 培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基分別統(tǒng)計(jì)2 種腐乳中總菌數(shù)(細(xì)菌)、乳酸菌數(shù)、酵母菌數(shù)和霉菌數(shù)。 將樣品稀釋液在80 ℃下水浴10 min 后, 利用PCA 培養(yǎng)基對(duì)芽孢桿菌計(jì)數(shù)。 由圖1a 可見,2 種腐乳中的細(xì)菌總數(shù)、乳酸菌數(shù)、芽孢桿菌數(shù)均處于同一數(shù)量級(jí)(107CFU/g),霉菌和酵母菌數(shù)目(10~104CFU/g)較少,其中白菜腐乳中酵母菌數(shù)目較多(104CFU/g),比香辣腐乳中酵母菌數(shù)高2 個(gè)數(shù)量級(jí), 這說明乳酸菌和芽孢桿菌在2 種腐乳中為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌, 酵母菌在白菜腐乳的真菌中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。根據(jù)圖1b,2 種腐中乳酸菌數(shù)和細(xì)菌總數(shù)接近,芽孢桿菌數(shù)(白菜腐乳1.28×107CFU/g;香辣腐乳1.77×107CFU/g)相對(duì)少于乳酸菌(白菜腐乳2.51×107CFU/g; 香辣腐乳2.40×107CFU/g),其中以香辣腐乳中芽孢桿菌較多。
圖1 2 種腐乳樣本中的微生物種類及數(shù)目Fig.1 The taxon and number of microorganism in the two kinds of fermented bean curd samples
通過Illumina Miseq 測(cè)序共獲得187 204 條序列,其平均讀長425 bp,范圍為400~450 bp,其中香辣腐乳和白菜腐乳中微生物序列的平均讀長分別為426 bp 和424 bp。 對(duì)2 種樣本的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行多樣性指數(shù)分析, 可估計(jì)環(huán)境群落的物種豐度和多樣性,并衡量測(cè)序數(shù)據(jù)的合理性。由表1 可知,Chao 和Ace 指數(shù)在同一樣本下數(shù)值相同,說明物種總數(shù)估計(jì)結(jié)果可靠, 其中香辣腐乳和白菜腐乳細(xì)菌OTUs 均為62,真菌OUTs 分別為19 和27。 根據(jù)Shannon 和Simpson 指數(shù),可知白菜腐乳中細(xì)菌的群落多樣性高于香辣腐乳, 而香辣腐乳中真菌的多樣性高于白菜腐乳。由此可見,白菜腐乳中真菌OTU 數(shù)較高, 而其多樣性不及香辣腐乳。 Coverage 指數(shù)值在表1 中均達(dá)0.9999,說明樣本文庫覆蓋率很高, 本次測(cè)序結(jié)果可代表樣本中細(xì)菌和真菌的真實(shí)情況。
由表2 可知,厚壁菌門(Firmicutes,75.06%)、變形菌門 (Proteobacteria,10.17%)、 放線菌門(Actinobacteria,7.33%)在白菜腐乳中的含量較高。 厚壁菌門和變形菌門同樣也是香辣白菜中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門, 其中以厚壁菌門占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(90.27%)。 子囊菌門(Ascomycota)是白菜腐乳中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌門,占比高達(dá)98.81%,其它門的占比均小于1%。 在香辣腐乳中,子囊菌門的占比也很高(85.57%), 其次是地位未定真菌(Fungi_incertae_sedis,9.8%)。 由此可見,2 種腐乳中的微生物在門分類水平上具有一定的相似性, 其中厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門,子囊菌門為優(yōu)勢(shì)真菌門。雖然其它類別門組成具有一定差異, 但優(yōu)勢(shì)菌門差異不大。
表1 2 種腐乳樣本中細(xì)菌(a)和真菌(b)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)匯總Table 1 Data summary of high-throughput sequencing of bacteria(a)and fungi(b)of two kinds of fermented bean curd samples
表2 2 種腐乳樣本中微生物在門分類水平上的組成Table 2 Composition of microorganism at the level of Phylum of two kinds of fermented bean curd samples
對(duì)香辣腐乳和白菜腐乳中的微生物在目水平上進(jìn)行相似性聚類,得到聚類分析熱圖。 由圖2a可知,2 種腐乳中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌目均為厚壁菌門下的芽孢桿菌目 (Bacillales)(香辣腐乳64.83%,白菜腐乳41.27%)和乳桿菌目(Lactobacillales)(香辣腐乳25.32%,白菜腐乳33.80%),這2 個(gè)目的微生物在其樣本中的豐度比具有較大差異(香辣腐乳2.56∶1,白菜腐乳1.22∶1)。此外,一些其它細(xì)菌目在2 種樣本中的含量也存在較大差異, 其中腸桿菌目 (Enterobacteriales)在香辣腐乳中含量較高,微球菌目(Mcrococcales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)和黃桿菌目(Flavobacteriales)在白菜腐乳中含量較高。 由圖2b 可知,散囊菌目(Eurotiales,38.82%)在香辣腐乳中含量最高,其次是腔菌目(Pleosporales,21.97%)和肉座菌目(Hypocreales,15.63% ), 在目水平未分類真菌(norank_k__Fungi,9.80%);而在白菜腐乳中,酵母目(Saccharomycetales,86.98%)占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì),除腔菌目(8.07%)外,其它真菌目占比均小于1%。 此外, 通過聚類分析熱圖的顏色分布可以清晰地看出,在目水平上,白菜腐乳中細(xì)菌群落均勻性要高于香辣腐乳, 而其真菌組成卻高度集中在酵母目上。
圖2 2 種腐乳樣本中細(xì)菌(a)和真菌(b)OTUs 豐度聚類熱圖Fig.2 Abundance clustering heat map of OTUs of bacteria(a)and fungi(b)of two kinds of fermented bean curd samples
圖3 2 種腐乳樣本中細(xì)菌(a)和真菌(b)屬水平系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree on Genus bar of bacteria (a)and fungi (b)of two kinds of fermented bean curd samples
根據(jù)序列間堿基的差異, 在屬分類水平上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。 由圖3a 可知,2 種腐乳中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌集中在少數(shù)屬上, 其中含量最高的是芽孢桿菌屬 (Bacillus)(香辣腐乳63.41%, 白菜腐乳40.06%), 其次是乳酸菌 (lactic acid bacteria,LAB)有關(guān)屬,主要包括腸球菌屬、鏈球菌屬、四聯(lián)球菌屬)和乳球菌屬,其中鏈球菌屬在香辣腐乳中含量較高(11.81%),腸球菌屬(20.07%)、四聯(lián)球菌屬(7.93%)和乳球菌屬(3.62%)在白菜腐乳中含量較高。此外,香辣腐乳中泛生菌屬(Pantoea)含量遠(yuǎn)高于白菜腐乳 (3.91%,0.06%), 而不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)在白菜腐乳中的含量遠(yuǎn)高于香辣腐乳(5.86%,0.68%),這說明兩腐乳樣本中的某些非優(yōu)勢(shì)細(xì)菌存在著較大的差異。 由圖3b 可知,曲霉屬(Aspergillus)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)和鐮刀菌屬(Fusarium)在香辣腐乳中含量較高,占比分別為38.82%,21.97%,15.63%,在白菜腐乳中的含量卻很少,占比分別為8.07%,0.56%,2.03%;畢赤酵母屬(Pichia),未分類酵母目(與畢赤酵母屬親緣關(guān)系較近)是白菜腐乳中的優(yōu)勢(shì)真菌屬,占比分別為56.99%和29.16%,在香辣腐乳中含量卻非常少,分別為2.54%和1.21%。由此可見,兩腐乳樣品中優(yōu)勢(shì)真菌在屬水平上具有很大差異。
檢測(cè)夾江腐乳中的微生物, 發(fā)現(xiàn)2 種腐乳樣品中細(xì)菌的數(shù)目和多樣性均遠(yuǎn)高于真菌, 且優(yōu)勢(shì)細(xì)菌組成具有一定的相似性, 優(yōu)勢(shì)真菌組成差異較大。 芽孢桿菌屬和乳酸菌(LAB)有關(guān)屬為2 種腐乳的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬, 曲霉菌屬和旋孢腔菌屬為香辣腐乳中優(yōu)勢(shì)真菌屬, 酵母菌有關(guān)屬為白菜腐乳中的優(yōu)勢(shì)真菌屬。
除了含量較高的優(yōu)勢(shì)微生物類群, 高通量測(cè)序還鑒定出一些其它微生物,如腸桿菌目、黃桿菌目、假單胞菌目和微球菌目的細(xì)菌,毛霉目、煤炱目和銀耳目的真菌。 腸桿菌、黃桿菌、假單胞菌和微球菌等被證實(shí)會(huì)造成食品污染和腐敗[15]。 為避免食品質(zhì)量安全問題, 需關(guān)注其含量及比例。 不過,由于夾江腐乳的生產(chǎn)工藝為自然發(fā)酵,所以在其中發(fā)現(xiàn)一些來自于原材料和環(huán)境中的微生物是正?,F(xiàn)象。
對(duì)2 種腐乳中的微生物計(jì)數(shù), 發(fā)現(xiàn)乳酸菌的數(shù)目高于芽孢桿菌,且與總細(xì)菌數(shù)接近。測(cè)序結(jié)果顯示芽孢桿菌豐度高于乳酸菌, 乳酸菌在2 種腐乳中的豐度均在50%以下。 分析原因可能是芽孢桿菌生命力強(qiáng),其中大多數(shù)能在基礎(chǔ)MRS 培養(yǎng)基上生長,加上芽孢桿菌屬內(nèi)的一些產(chǎn)乳酸成員,如凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans),也應(yīng)該屬于乳酸菌范疇[16]。 由于營養(yǎng)物質(zhì)和生長條件的限制,許多微生物無法在培養(yǎng)基上生長, 再加上芽孢桿菌與其它可培養(yǎng)細(xì)菌的競(jìng)爭(zhēng)作用, 所以總細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果要小于樣品中實(shí)際的細(xì)菌數(shù)[3]。
另外,在白菜腐乳中占比相對(duì)較高(29%)的一個(gè)OUT(未分類酵母目),在測(cè)序結(jié)果中的科屬水平上未得到分類, 這說明目前還有一些菌株尚未被測(cè)序或注釋; 同時(shí)由于較短的測(cè)序片段和數(shù)據(jù)庫的限制, 一些微生物測(cè)序結(jié)果只能達(dá)到屬分類水平[6,17],這說明當(dāng)前這一技術(shù)依然存在短板,有必要與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)合來研究微生物多樣性。
令人意外的是,雖然白菜腐乳中有“白菜”這一特別的材料, 但是其中乳酸菌并不比芽孢桿菌占優(yōu)勢(shì), 分析原因可能是較高的含鹽量抑制了乳酸菌自身繁殖和對(duì)白菜的發(fā)酵, 不過其中微生物競(jìng)爭(zhēng)作用的因素也是不可排除的。 盡管如此,2 種腐乳中的乳酸菌組成具有較大的差別, 白菜腐乳中以腸球菌屬占優(yōu)勢(shì), 香辣腐乳中以鏈球菌屬占優(yōu)勢(shì),腸球菌屬常見于蔬菜類樣品,鏈球菌屬常見于蛋白質(zhì)類樣品[15]。 這說明白菜對(duì)腐乳中乳酸菌的組成及比例有一定影響。
需要注意的是,在香辣腐乳中,旋孢腔菌屬和鐮刀菌屬在真菌中占比高達(dá)21.97%和15.63%。這2 類真菌在自然界中廣泛分布,可侵染多種作物[18-19],其中多種真菌可以產(chǎn)生對(duì)人、 畜健康有極大威脅的真菌毒素, 如多種鐮刀菌可產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀烯醇(DON),引起頭暈、嘔吐、食欲喪失、腹瀉以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等癥狀[20]。 然而,旋孢腔菌屬和鐮刀菌屬在白菜腐乳中含量極少, 一方面可能是白菜腐乳中酵母菌數(shù)目較多, 拮抗作用抑制了其它真菌的生長[21];另一方面可能是腸球菌屬細(xì)菌在白菜腐乳中含量較高,產(chǎn)生某種抗菌物質(zhì),如細(xì)菌素,進(jìn)而對(duì)有害菌起到一定的殺滅作用[22]。
總體來看,夾江腐乳中的微生物是多樣的、復(fù)雜的, 香辣腐乳和白菜腐乳中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌均為芽孢桿菌和乳酸菌, 優(yōu)勢(shì)真菌分別為曲霉菌和酵母菌。原料的不同會(huì)導(dǎo)致微生物組成的較大差異,白菜腐乳中乳酸菌和酵母菌的數(shù)目和種類明顯高于香辣腐乳。