王爭，裴小華，趙衛(wèi)紅

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年腎科，江蘇省老年醫(yī)學重點實驗室，南京 210029)

近年來，慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)的患病率逐年增高，已成為一個重大的公共衛(wèi)生問題[1]。其中，腎小管間質(zhì)纖維化是CKD進展至終末期腎病的關(guān)鍵過程。微小RNA(miRNA,miR)是一類內(nèi)源性短鏈(21～25個核苷酸)非編碼RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后水平負向調(diào)控mRNA，抑制轉(zhuǎn)錄，廣泛參與腎臟的生理和病理過程[2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與了自噬的調(diào)節(jié)過程，在腫瘤、衰老、纖維化等發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。微管相關(guān)蛋白-輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)是自噬的標記蛋白，在自噬過程中LC3-Ⅰ可募集磷脂酰乙胺醇形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的大小可反映自噬小體的合成情況。在miRNA家族中，miR-200c定位于染色體12p13.31上，其在多種器官纖維化中均有參與，但作用機制仍不清楚。另外，Smad蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)誘導纖維化作用的關(guān)鍵細胞內(nèi)效應分子，其中Smad2和Smad3具有較高的同源性，在許多細胞中都可以被TGF-β1激活；鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)減少或缺失是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的標志性變化；同時α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)的重新表達或表達水平增加說明上皮細胞形態(tài)學發(fā)生了轉(zhuǎn)化。本研究以TGF-β1刺激人腎近曲小管上皮細胞HK2，體外構(gòu)建纖維化細胞模型，探索miR-200c對小管細胞中自噬變化的調(diào)節(jié)，為延緩腎小管間質(zhì)纖維化提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人腎臟近曲小管上皮細胞HK-2(ATCC，美國)，DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國)，TGF-β1(Peprotech，美國)，兔抗LC3(LC3Ⅱ/Ⅰ)、P62、E-cad、Smad2、Smad3、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體(CST,美國)，兔抗α-SMA多克隆抗體(三鷹生物技術(shù)有限公司，中國武漢)，miR-200c引物、U6引物、micrON miRNA mimic、riboFECT CP轉(zhuǎn)染試劑(銳博生物科技有限公司，中國廣州)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HK2細胞采用DMEM/F12培養(yǎng)基 + 10%胎牛血清，在5% CO2、37℃完全飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞達80%～90%融合時用0.25%胰酶消化，以1∶3比例傳代，選擇對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 細胞形態(tài)學變化 分別在倒置顯微鏡下觀察不同濃度(0、5、10、15、20、30 ng/ml)TGF-β1刺激48 h后的HK2細胞形態(tài)變化，并拍照采集圖片。

1.2.3 CCK8檢測細胞活性 HK2細胞消化后以每孔5 000個細胞接種至96孔板中，每個濃度設置5個復孔，待細胞貼壁后于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中加入不同濃度TGF-β1刺激HK2細胞48 h，然后每孔加入10 μl CCK8試劑，于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，在450 nm處檢測各孔吸光度A(A450nm)。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染及分組 選擇致細胞增殖最快的TGF-β1濃度(c)制作纖維化模型。將約4×105個細胞接種于6孔板中，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞密度達到30%～50%融合時換無血清、無雙抗培養(yǎng)液以備轉(zhuǎn)染。按照轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，轉(zhuǎn)染濃度40 nmol/L。分組：(1)細胞轉(zhuǎn)染40 nmol/L無意義序列RNA(NC組)；(2)細胞轉(zhuǎn)染40 nmol/L無意義序列RNA后濃度為c的TGF-β1處理細胞48 h(NC + T組)；(3)細胞轉(zhuǎn)染40 nmol/L miR-200c mimics(M組)；(4)細胞轉(zhuǎn)染40 nmol/L miR-200c mimics后濃度為c的TGF-β1處理細胞48 h(M + T組)。

1.2.5 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率 細胞處理完后，用TRIzol試劑提取總RNA，按照Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR定量檢測。U6作為內(nèi)參基因，2-ΔΔCT法計算miR-200c相對表達量，以表達量升高30倍為轉(zhuǎn)染有效。

1.2.6 Western blotting檢測蛋白表達 消化收集各組細胞，預冷PBS清洗3遍后，根據(jù)細胞量加入適量RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，12 000轉(zhuǎn)/min，4℃離心20 min。BCA法測定蛋白濃度。取5～30 μg總蛋白進行凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移蛋白至0.22 μm的PVDF膜上，5%脫脂牛奶(TBST配制)室溫封閉1 h。加入1∶1 000稀釋的抗體Smad2、Smad3、E-cadherin、α-SMA、LC3、P62等4℃孵育過夜，洗膜(10 min×3次)后，加入1∶10 000的二抗4℃ 2 h，再次洗膜(10 min×3次)后，顯影。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度TGF-β1對HK2細胞形態(tài)的影響

不同濃度(0、5、10、15、20、30 ng/ml)的TGF-β1分別誘導HK-2細胞48 h后，隨著TGF-β1濃度的增加HK-2細胞形態(tài)由正常的卵圓形鋪路石狀，逐漸呈成纖維細胞形態(tài)，即出現(xiàn)細胞長梭形改變。5 ng/ml時細胞形態(tài)逐漸變化，10及15 ng/ml時細胞纖維化形態(tài)明顯，30 ng/ml時細胞開始調(diào)亡(圖1)。

圖1 不同濃度TGF-β1刺激HK2細胞48 h后形態(tài)變化

2.2 不同濃度TGF-β1對HK2細胞活性的影響

CCK-8結(jié)果顯示，不同濃度(0、5、10、15、20、30 ng/ml)TGF-β1分別誘導HK-2細胞48 h后A450nm分別為1.59±0.02、1.68±0.02、1.85±0.03、1.70±0.03、1.29±0.00、1.21±0.00。TGF-β1在10 ng/ml濃度時，細胞增殖最明顯，與其他濃度組相比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結(jié)合10、15 ng/ml時細胞的形態(tài)改變，選擇10 ng/ml作為刺激濃度。

2.3 轉(zhuǎn)染效率檢測

qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了miR-200c mimics的細胞(M組)中miR-200c的表達量是NC組的(212.42±12.25)倍(t=24.41，P=0.000)，說明轉(zhuǎn)染有效。

2.4 4組HK2細胞纖維化水平比較

Western blotting結(jié)果顯示，與NC組比較，NC + T組加入10 ng/ml的TGF-β1刺激HK2細胞48 h后，Smad2、Smad3和α-SMA蛋白表達量增加，E-cadherin蛋白表達量降低(P<0.05)。與NC + T組比較，M + T組Smad2、Smad3和α-SMA蛋白表達量減少，E-cad蛋白表達量增加(P<0.05)，提示miR-200c表達增加抑制了纖維化(圖2)。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-200c mimics后細胞纖維化標志物的表達

2.5 4組HK2細胞自噬水平比較

進一步通過Western blotting分析發(fā)現(xiàn)，M組較NC組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達水平增加，P62表達水平降低，提示自噬活性增加。M + T組較NC + T組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達水平增加，P62表達水平降低，提示miR-200c緩解纖維化可能與增加自噬水平有關(guān)(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-200c mimics后自噬相關(guān)蛋白的表達

3 討 論

腎小管間質(zhì)纖維化是各種慢性腎病的共同點，主要表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)大量沉積、炎癥細胞的浸潤、成纖維細胞的活化與激活、EMT等，其中EMT是導致腎臟發(fā)生纖維化的重要因素[3]。TGF-β1作為TGF-β超家族的一員，是經(jīng)典的致纖維化因子。本課題組前期多項研究也顯示，腎小管上皮細胞在TGF-β1誘導下發(fā)生纖維化，磷酸化的Smad 2/3(p-Smad 2/3)蛋白水平表達量增加，E-cad在mRNA和蛋白水平表達量降低，α-SMA在mRNA和蛋白水平表達量增加[4-6]。TGF-β1可將位于細胞胞質(zhì)中的Smad 2和Smad 3磷酸化后轉(zhuǎn)移至細胞核中調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，介導EMT的發(fā)生[7]。此過程中，上皮細胞標志物E-cad的表達減少，間質(zhì)細胞標志物α-SMA表達增加。

miR-200c是miR-200家族的成員之一，參與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移與侵襲，以及纖維化的發(fā)生發(fā)展。近年來研究miR-200c調(diào)控纖維化的機制主要分為兩個方面，其一是參與EMT的過程，miR-200c可以靶向調(diào)控EMT轉(zhuǎn)錄因子ZEBs，抑制其表達水平[8]；另一方面，miR-200c與TGF-β/Smad信號通路之間的相互調(diào)控是纖維化發(fā)生發(fā)展的重要機制[9]。研究發(fā)現(xiàn)miR-200c的表達水平在特發(fā)性肺纖維化患者肺組織中下降[10]，在大鼠實驗性肺纖維化組織中表達亦下調(diào)，高表達miR-200c后可抑制TGF-β1誘導的EMT，從而逆轉(zhuǎn)肺纖維化[11]。Blahna等[12]研究發(fā)現(xiàn)在TGF-β的誘導下，位于miR-200c啟動子序列上的Smad結(jié)合位點與Smad3結(jié)合，可以抑制miR-200c的表達。EMT是指上皮細胞之間連接消失，細胞骨架重組，向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生成纖維細胞，最終導致組織器官纖維化的過程。TGF-β1是公認的致纖維化因子，主要以TGF-β1/smad信號傳導途徑介導EMT。miR-200c具有抗纖維化作用。本研究結(jié)果顯示，在TGF-β1誘導的腎臟纖維化模型中，轉(zhuǎn)染miR-200c mimics后，與NC+T組比較，Smad 2、Smad 3、α-SMA表達水平降低，E-cadherin表達水平增加，表明miR-200c可以抑制TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞纖維化。

自噬(autophagy)是在饑餓、缺氧或應激等狀態(tài)下，細胞內(nèi)受損的細胞器或多余蛋白質(zhì)被溶酶體降解的過程[13]。LC3和P62是監(jiān)測自噬的重要標志物。Livingston等[14]使用CAG-RFP-GFR-LC3自噬報告轉(zhuǎn)基因小鼠動態(tài)監(jiān)測單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)模型小鼠體內(nèi)自噬形成和成熟情況，結(jié)果顯示UUO早期即可出現(xiàn)自噬體形成，中后期自噬保持高水平活化狀態(tài)。新近的研究表明，miRNA在自噬過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。Xu等[15]發(fā)現(xiàn)miR-326可以靶向作用于PTBP1促進自噬，來緩解硅引起的肺臟纖維化。還有研究證明，在小鼠矽肺模型中過表達miR-449a，可增加小鼠體內(nèi)的自噬活性[16]。然而，miR-200c和自噬的調(diào)節(jié)在腎纖維化中的作用機制仍不清楚。本研究中，正常HK2細胞轉(zhuǎn)染miR-200c mimics后，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達明顯增加，P62表達降低，即miR-200c過表達促進了細胞自噬的發(fā)生。同時，M + T組較NC + T組的細胞自噬水平增加，且Smad 2、Smad 3、α-SMA表達水平降低，E-cadherin表達水平增加，提示miR-200c過表達可能通過增加自噬水平使纖維化得到緩解。

綜上所述，miR-200c可以促進細胞自噬的發(fā)生，并且可能通過激活自噬部分緩解TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞纖維化。此實驗探究了自噬與腎小管間質(zhì)纖維化之間的相互作用，對尋找腎臟纖維化潛在的治療靶點、發(fā)展新的預防措施和臨床診療方法意義重大。