張盼盼，陳勝國(guó)，薛志琴， 美合日古麗·薩塔爾， 潘曉楠， 童卓云

（新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊）

0 引言

睪酮（testosterone，T）作為最重要的雄激素，95%由睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig 細(xì)胞）合成分泌，高濃度的T 擴(kuò)散進(jìn)入精曲小管，保證精子的正常產(chǎn)生，若其分泌異常，可引發(fā)少弱精癥[1]。環(huán)境雌激素(environmental estrogens，EEs)可通過(guò)多種途徑抑制睪酮，而冷刺激亦可導(dǎo)致哺乳類(lèi)動(dòng)物內(nèi)分泌水平的紊亂[2]。本研究在前期研究報(bào)道的基礎(chǔ)上，采用芫荽實(shí)環(huán)境雌激素樣復(fù)合飼料聯(lián)合冷刺激進(jìn)行干預(yù)建立少弱精癥大鼠模型，探討環(huán)境雌激素聯(lián)合冷刺激對(duì)該大鼠模型血清性激素水平及睪丸形態(tài)學(xué)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

性成熟雄性SD 大鼠36 只，平均體重（220±10）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要儀器與試劑

冷凝機(jī)、DRS-09A 型超聲波加濕器（杭州多樂(lè)信電器有限公司）、BS-1150 型電子天平（北京賽多科斯天平有限公司）、水合氯醛(索來(lái)寶公司，批號(hào)：No.327D021）、T、E放免試劑盒（北京北方生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物模型的建立

隨機(jī)取12 只正常雄性大鼠為正常對(duì)照組（N 組），余24 只 為 造 模 組（M 組）。N 組 大 鼠 常 規(guī) 飼 養(yǎng)，溫 度為（25±2）℃，濕度為（55±5）%。造模組通過(guò)芫荽實(shí)雌激素樣復(fù)合飼料+ 冷刺激進(jìn)行干預(yù)，飼養(yǎng)條件為：溫度（10±2）℃、濕度（75±5）%，干預(yù)時(shí)間為每天9:00 至19:00。24 w 后，根據(jù)文獻(xiàn)方法[2]篩選出少弱精癥模型，設(shè)為M1組。

1.3.2 取材

建模24 w 后，7%水合氯醛(5 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，離心取上清。取雙側(cè)睪丸，一側(cè)睪丸入4%多聚甲醛，固定1 w 后行常規(guī)石蠟包埋、切片備用，將體積小于1 mm3的組織，用4%戊二醛和1%鋨酸雙固定。

1.3.3 血清激素水平檢測(cè)

按照大鼠T、E2放免試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察

將甲醛固定的睪丸組織進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片厚4 μm，常規(guī)蘇木精-伊紅 ( hematoxylin-eosin，HE)染色，中性樹(shù)膠封片后，光鏡下觀察。將戊二醛和鋨酸雙固定的睪丸組織丙酮梯度脫水，Epon 環(huán)氧樹(shù)脂包埋切片，鉛鈾染色（由新疆醫(yī)科大學(xué)電鏡室制作），JEOLJEM1230透視電鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素ANOVA 分析，兩兩比較采用LSD 法進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比(%)表示，組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清激素水平檢測(cè)結(jié)果

M1組較N 組T 水平顯著降低，E2水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 血清T、E2 水平變化（±s）

表1 血清T、E2 水平變化（±s）

注：與N 組比較，*P＜0.05

指標(biāo) N 組 M1 組T（ng/dL） 1.58±0.64 0.45±0.13*E2（uIU/ml） 31.67±5.63 71.34±6.24*

2.2 睪丸形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

正常組結(jié)構(gòu)完好，模型組可見(jiàn)生精小管明顯變形，各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)量明顯減少，間質(zhì)減少；超微結(jié)構(gòu)顯示，生精細(xì)胞數(shù)量減少且排列紊亂，可見(jiàn)有精原細(xì)胞、精母細(xì)胞核固縮，精子細(xì)胞界限模糊不清（圖1）。

圖1 各組大鼠睪丸光鏡、電鏡結(jié)果

3 討論

睪酮合成途徑非常復(fù)雜，由多種酶參與催化，且受到激素、溫度、環(huán)境等多種因素調(diào)節(jié)。

精子生成于睪丸的曲細(xì)精管，曲細(xì)精管間的疏松結(jié)締組織稱(chēng)為睪丸間質(zhì)，睪丸間質(zhì)中的間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cell），從青春期開(kāi)始，受垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的間質(zhì)細(xì)胞刺激素的作用，能合成分泌雄性激素，可促進(jìn)精子的發(fā)生和男性生殖器官發(fā)育，以及維持男性正常的第二性征和性功能[3]。

有學(xué)者通過(guò)神經(jīng)肽W 刺激睪丸Leydig 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)睪丸Leydig 細(xì)胞數(shù)量明顯增加，T 的分泌也隨之增加[4]；另有學(xué)者J Li[5]等通過(guò)連續(xù)灌胃環(huán)磷酰胺建立大鼠少精子癥模型，發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺組大鼠睪丸Leydig 細(xì)胞數(shù)量減少，精子數(shù)量、活率、活力及睪丸重量均顯著降低，精子畸形率顯著升高。而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)環(huán)境雌激素聯(lián)合慢性冷刺激所建立的少弱精癥大鼠模型中， HE 染色及電鏡結(jié)果均顯示Leydig 細(xì)胞數(shù)量亦明顯減少，和上述結(jié)果一致[6]。

綜上所述，我們認(rèn)為L(zhǎng)eydig 細(xì)胞數(shù)量的減少是導(dǎo)致該模型睪酮水平下降的直接因素，故睪丸形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的改變可能是少弱精癥發(fā)生的組織病理學(xué)基礎(chǔ)，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究[7,8]。