許佳蒞

摘 要：以嘉興海寧地區(qū)鴨場送檢的4份病料（腦組織、肝臟、脾臟等）為材料，通過增菌及分離培養(yǎng)獲得疑似大腸桿菌1株;進(jìn)一步通過革蘭氏染色鏡檢及PCR檢測，鑒定陽性1株;對分離得到的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，分離菌株對慶大霉素、丁胺卡那2種藥物高度敏感。

關(guān)鍵詞：鴨源大腸桿菌;分離鑒定;耐藥性

中圖分類號 S852.61+2文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）15-0099-03

大腸桿菌是目前對養(yǎng)鴨業(yè)危害最為嚴(yán)重的高致病性細(xì)菌之一，其血清型眾多且分布廣泛。各養(yǎng)殖場通常使用抗生素來預(yù)防和治療大腸桿菌病，但長期大量不合理的使用導(dǎo)致大腸桿菌耐藥頻譜不斷擴(kuò)大，甚至有些菌株已面臨無藥可用的現(xiàn)狀。因此，有必要根據(jù)不同地區(qū)甚至相同地區(qū)不同養(yǎng)殖場的大腸桿菌流行現(xiàn)狀，規(guī)范、合理使用抗生素。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 送檢的疑似病例來自海寧地區(qū)的養(yǎng)鴨場，經(jīng)過無菌操作采集病死鴨的腦、肝臟及心臟等器官備用。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 麥康凱培養(yǎng)基（MacC）、LB液體培養(yǎng)基、生化鑒定管均購自上海博微生物科技有限公司，DNA Marker DL 2000、10×Loading buffer為大連寶生（Takara）生物工程公司產(chǎn)品，Gel Red核酸染料購自上海生工生物科技有限公司，50×TAE電泳緩沖液購自上海碧云天生物科技有限公司，引物購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 藥敏試紙 試驗(yàn)使用的抗生素藥敏試紙（共包含10種抗生素，為氯霉素、復(fù)方新諾明、頭孢唑啉、諾氟沙星、紅霉素、慶大霉素、丁胺卡那、環(huán)丙沙星、氨芐青霉素、青霉素）購自杭州微生物試劑有限公司，Premix Taq酶訂購于寶生生物技術(shù)（北京）有限公司。香柏油為上海懿洋儀器有限公司生產(chǎn)，革蘭氏染色液購自杭州微生物試劑有限公司，抗菌藥物藥敏紙片為杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌的分離純化 無菌操作采集病死鴨的腦、肝臟以及心包液等器官，將其接種在新制的麥康凱平板上，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中于37℃有氧培養(yǎng)24h。觀察細(xì)菌的生長情況，并挑取疑似大腸桿菌的單菌落于麥康凱平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24～48h。觀察平板中細(xì)菌生長情況，可見到針尖大小、紫紅色菌落，再挑取單個(gè)菌落作進(jìn)一步純化培養(yǎng)。純培養(yǎng)物進(jìn)行MacC平板劃板純化，37℃培養(yǎng)24～48h作初步鑒定。挑選疑似大腸桿菌的純菌落接種于LB液體培養(yǎng)基上，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)24h，觀察菌液并與麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，確定渾濁度以確定細(xì)菌活性。此菌液用于PCR鑒定。

1.2.2 革蘭氏染色 選取于4℃冰箱中生長旺盛的平板，使用潔凈接種環(huán)于平板中挑取明顯菌落中大腸桿菌進(jìn)行革蘭氏染色。首先于載玻片上滴1滴無菌水，將環(huán)上菌體于水中攪拌數(shù)次，然后在酒精燈火焰上方通過5～6次以殺滅菌體并將水分蒸干。液體蒸干后滴加結(jié)晶紫染料，1min后將玻片傾斜45°用純凈水沖洗干凈多余染料，并用濾紙吸干多余水分。滴加碘溶液至玻片中心，靜置1min，用純凈水沖洗并用濾紙吸干多余水分，然后用95%乙醇溶劑進(jìn)行脫色漂洗。下襯白紙，待無有色液體洗出后停止加入乙醇，并用無菌水洗去過量的乙醇溶劑，然后用純凈水沖洗干凈。使用番紅染色劑染色2min后用純凈水沖凈并吸干多余水分。如此重復(fù)6次得到大腸桿菌的革蘭氏染色片。

1.2.3 生化試驗(yàn) 將純化的菌株接種到腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管，37℃培養(yǎng)24h。

1.2.4 PCR檢測 （1）引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)GenBank中大腸桿菌外膜蛋白A編碼序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列設(shè)計(jì)見表1。（2）反應(yīng)體系的配置：以上述步驟獲得的菌液作為模板進(jìn)行菌液PCR檢測，按照使用說明配制PCR反應(yīng)體系。（3）反應(yīng)程序設(shè)置：PCR反應(yīng)體系設(shè)定完成后，按照表2中程序設(shè)定PCR儀程序。（4）凝膠電泳成像：以提取的大腸桿菌質(zhì)粒DNA為模板，擴(kuò)增大腸桿菌基因，并通過凝膠電泳檢測。首先觀察電泳槽的水平情況，通過調(diào)節(jié)腳墊旋鈕將電泳槽置于水平面上。此后在30mL 1×TAE電泳緩沖液中稱取0.24g瓊脂糖，將瓊脂糖顆粒在微波爐中完全溶解，冷卻至50℃時(shí)加入10×上樣緩沖液，混合并倒入橡膠板中并放置梳子，凝固后除去。然后將PCR反應(yīng)產(chǎn)物與溴酚藍(lán)混合并依次加到固化的凝膠孔中。在PCR反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)定120V、100mA于1×TAE電泳緩沖液中電泳，膠體右側(cè)滴加marker。最后將電泳檢測擴(kuò)增條帶置于凝膠成像系統(tǒng)中成像并記錄。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 吸取搖床37℃培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中菌液于麥康凱培養(yǎng)基中涂覆3次，每次旋轉(zhuǎn)60°，最后涂覆一周以確保足夠均勻。37℃培養(yǎng)12h，用生理鹽水稀釋至與麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管濁度相同的濃度，然后置于瓊脂平板上晾干后倒置保存。用鑷子蘸取95%乙醇并通過火焰，待燒干后再蘸取乙醇重復(fù)上述操作3次。待冷卻后，用此無菌鑷子夾取不同藥敏紙片，按一定間隔貼在平板的不同區(qū)域，兩紙片間距不小于24mm，紙片距平板邊緣不小于15mm。將藥物敏感試紙置于培養(yǎng)基表面并壓緊。每只平板等間距放置5張藥敏試紙。于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。最后，參照CLSI藥敏性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于桿菌科的標(biāo)準(zhǔn)，在保證試驗(yàn)結(jié)果無明顯誤差的情況下，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，獲得分離菌敏感性試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌分離鑒定及鏡檢結(jié)果 所得的菌株在37℃劃線上的麥康凱板并培養(yǎng)20h。MacC瓊脂上可以看到紫紅色干菌落，形狀具有倒圓的起伏，表面平整、濕潤，邊緣圓滑，直徑3mm左右，為典型的大腸桿菌菌落特性。挑取典型菌落接種于培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)。從培養(yǎng)基中挑取菌體加入新制成的LB液體培養(yǎng)基中，蓋上硅膠塞后置于搖床上160r/min、37℃振蕩培養(yǎng)24h。次日觀察菌種均在LB液體培養(yǎng)基中正常生長呈渾濁狀態(tài)，且試管底部出現(xiàn)絮狀沉淀。在100×10倍油鏡下觀察：所提取菌種為革蘭陰性G-，鏡中菌體成短小鈍頭細(xì)桿狀，單個(gè)生長或成對出現(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)芽孢或莢膜。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果 該細(xì)菌能夠發(fā)酵甘露醇、葡萄糖、乳糖和麥芽糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣;發(fā)酵蔗糖，不產(chǎn)氣;MR試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)陽性;硫化氫試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)和尿素酶試驗(yàn)為陰性。生化試驗(yàn)結(jié)果符合大腸桿菌的生化特性。

2.3 PCR鑒定 按上述PCR反應(yīng)條件和程序設(shè)定，對提取到的菌體進(jìn)行PCR后與上樣緩沖液混合，將其滴入電泳凝膠孔洞中，最右側(cè)孔道中滴加Marker。設(shè)定電泳儀120V、100mA，于1×TAE電泳緩沖液中進(jìn)行電泳20min，將電泳凝膠置于熒光成像系統(tǒng)中觀察，菌體出現(xiàn)大小與濃度接近的250bp目的基因片段（見圖1），因此PCR結(jié)果確定菌體為大腸桿菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，獲得大腸桿菌敏感性試驗(yàn)結(jié)果（表3）：分離菌對慶大霉素、丁胺卡那2種藥物高度敏感;對其他8種藥物低敏感度或不敏感。

3 結(jié)論與討論

鴨大腸桿菌病感染鴨后可引發(fā)氣囊炎、關(guān)節(jié)炎、腹膜炎、心包炎等疾病，嚴(yán)重影響禽畜類生長和發(fā)育，甚至導(dǎo)致死亡，尤其在大規(guī)模養(yǎng)殖企業(yè)頻發(fā)，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益下降。在本地鴨群飼養(yǎng)過程中，鴨大腸桿菌病與其他病菌交叉感染并相互影響，病癥出現(xiàn)多發(fā)性的特異性，給防范和防治帶來較大困難。本試驗(yàn)篩選出對該養(yǎng)殖場大腸桿菌高度敏感的2種藥物慶大霉素和丁胺卡那，能夠預(yù)防和治療大腸桿菌病。

參考文獻(xiàn)

[1]何雪梅，郭莉娟，吳國艷，等.豬肉源大腸桿菌對抗生素及消毒劑的耐藥性[J].食品科學(xué)，2014，35（7）：132-137.

[2]舒紅云，孫國強(qiáng)，傅媛，等.大腸桿菌的qnrB基因檢測與耐藥機(jī)制研究[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2014，14（9）：1131-1133，1137

[3]王婷玉，陳永麗，吳月，等.高壓脈沖電場對鮮切蘋果中大腸桿菌殺菌效果的影響[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2018，37（7）：2928-2936.

[4]楊移斌，胥寧，董靖，等.臺灣泥鰍源維氏氣單胞菌Zy01株的分離鑒定及藥敏特性研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，2017（4）：852-858.

[5]陳言峰，馮偉強(qiáng)，陳建酬，等.寶石鱸嗜水氣單胞菌的鑒定及藥敏特性[J].水產(chǎn)科學(xué)，2016（7）：15.

[6]張業(yè)懷，凌丁.豬壞死性皮炎病原菌分離鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)[J]. 廣西農(nóng)學(xué)報(bào)，2017.16（4）：33.

[7]Stoll B J， Hansen N I， Sanchez P J， et al. Early Onset Neonatal Sepsis：The Burden of Group B Streptococcal and E. coli Disease Continues[J]. PEDIATRICS， 2011， 127（5）：817-826.

[8]雷連成，江文正，韓文瑜，等.致病性大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測[J].中國獸醫(yī)雜志，2001，37（1）：66-68.

[9]刁有祥，李久芹，陳慶普.山東省雞大腸桿菌的分離鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002（1）：21-23.

[10]許于學(xué)輝，程安春，汪銘書，等.鴨源致病性大腸桿菌的血清型鑒定及其相關(guān)毒力基因分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39（1）：74-75.

[11]李玲，汪銘書，程安春，等.雛鴨致病性大腸桿菌的分離鑒定藥敏試驗(yàn)及耐藥性分析[J].中國獸醫(yī)雜志，2007，43（12）：34-36.

[12]楊覃宗華，蔡建平，呂敏娜，等.鴨疫里默氏菌病和大腸桿菌病鑒別診斷雙重PCR方法的建立和應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39（4）：18.

[13]陳文靜，韓先干，何亮，等.鴨致病性大腸桿菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性分析[J].中國動物傳染病學(xué)報(bào)，2010（2）：34-40.

（責(zé)編：徐世紅）