謝朝新　王濤　龍向宇　唐然　陶光建　王嘉粵

摘????? 要：強化生物除磷是經(jīng)濟有效去除污水中磷（P）的重要方法，已廣泛應用于水環(huán)境保護領域。EBPR系統(tǒng)成功運行的關鍵在于聚磷菌（PAOs）通過聚磷代謝（PAM）富集聚磷酸鹽（poly-P），獲得碳源競爭優(yōu)勢，成為優(yōu)勢菌種。其中Accumulibacter菌是EBPR系統(tǒng)實現(xiàn)生物除磷的重要菌群，且主要存在Type I型和Type II型兩種類型的進化枝?？偨Y了EBPR系統(tǒng)中常見的PAOs，并對Accumulibacter為主的進化枝進行了鑒別。從碳源、溫度和電子受體3個方面探討了Accumulibacter進化枝的代謝特性?？偨Y了現(xiàn)有認知的不足和對未來研究方向進行了展望。

關? 鍵? 詞：強化生物除磷;聚磷菌;進化枝;代謝特性

中圖分類號：X524??????? 文獻標識碼： A???? ???文章編號： 1671-0460（2020）07-1513-06

Research Progress in Community Structure and Branching of

Polyphosphate Accumulating Organisms in EBPR System

XIEChao-xin1， WANGTao1， LONG Xiang-yu1*， TANG Ran2， TAO Guang-jian1， WANG Jia-yue1

（1. Army Logistic University of PLA， Chongqing 401331， China;

2. Chongqing University of Science & Technology， Chongqing 401331， China）

Abstract： Enhanced biological phosphorus removal is an important method to remove phosphorus （P） from wastewater economically and effectively. The key to the successful operation of EBPR system is that polyphosphate accumulating organisms （PAOs）can accumulate polyphosphate （ poly-P） through polyphosphate metabolism to obtain carbon source competitive advantage and become the dominant bacterial. Accumulibacter bacteria is an important bacteria group in EBPR system to realize biological phosphorus removal， and there are mainly type I and type II evolutionary strains. In this paper， the common PAOs in EBPR system were summarized， and the evolvement branch of Accumulibacter was differentiated. Then the metabolic characteristics of Accumulibacter evolvement branch were discussed from three aspects of carbon source， temperature and electron acceptor. Finally， the existing cognitive deficiencies were summarized， and the future research direction was prospected.

Key words： Enhanced biological phosphorus removal; PAOs; Clade; Metabolic characteristics

目前，我國湖泊（水庫）富營養(yǎng)化形勢依然嚴峻，磷（P）元素是導致湖泊（水庫）富營養(yǎng)化最為關鍵的限制性因素，為此國家和地方政府對污水處理廠出水磷濃度制定了嚴格的排放標準。強化生物除磷（EBPR）是一種處理成本低和環(huán)境友好的技術，已廣泛用于實際污水處理廠。普遍認為，EBPR過程是基于聚磷菌（PAOs）厭氧釋磷、好氧過量吸磷的原理，通過排放剩余富磷污泥實現(xiàn)良好的除磷效果。厭氧條件下，PAOs分解胞內(nèi)poly-P和糖原，吸收揮發(fā)性脂肪酸（VFAs，如乙酸和丙酸）并合成PHAs儲存;缺氧/好氧條件下分解胞內(nèi)PHAs提供能量用于糖原恢復、poly-P的合成以及維持微生物生長代謝。

EBPR系統(tǒng)微生物種群具有多樣性和復雜性，采用分子生物學技術（如，原位熒光雜交（FISH）、實時熒光定量PCR（qPCR）、16SrRNA和宏基因組測序等）能夠有效的促進PAOs的識別^[1-2]。目前，PAOs被廣泛定義為利用poly-P提供厭氧階段攝取碳源能量的所有微生物^[3]，其中β變形菌中與紅環(huán)菌屬相關的β-2亞組（Candidatus_Accumulibacter_phosphatis）是廣泛存在于EBPR系統(tǒng)的典型PAOs^[2-3]?；?em>Accumulibacter的ppk1基因的差異，Accumulibacter又可以分為兩種類型（Type I型和Type II型），并且Type I型又可以進一步分為進化枝IA-E共5個分支，Type II型又可以進一步分為進化枝IIA-G共7個分支。此外，大量研究表明不同的進化枝的PAOs常常表現(xiàn)出不同的生理特性。因此，有必要進一步了解Accumulibacter進化枝的代謝特性，提高EBPR系統(tǒng)運行的穩(wěn)定性和可靠性^[4]。

1 ?EBPR系統(tǒng)內(nèi)的聚磷菌

Fuhs和Chen^[5]在1975年利用純培養(yǎng)技術最早將Acinetobacter鑒定為EBPR中主要的除磷微生物菌種，并且Acinetobacter長期都被認為是唯一的PAO。然而，Wagner 等^[6]在全規(guī)模污水處理廠中采用專一FISH探針研究發(fā)現(xiàn)，與β-變形菌和Actinobacteria等其它系統(tǒng)發(fā)育菌群相比，Acinetobacter的除磷作用相對較低。

盡管PAOs分離培養(yǎng)困難，近十年來，分子技術在PAOs菌群鑒定上的應用取得了一定的進展。Bond 等^[7-8]采用了基因庫系統(tǒng)發(fā)育分析技術（16S rRNA）和熒光原位雜交技術（FISH）研究了EBPR污泥和非EBPR污泥中菌群結構的差異，他們發(fā)現(xiàn)β-變形菌亞綱2下的Rhodocyclus屬是除磷菌群中的主要微生物。與Rhodocyclus緊密相關的β-變形菌亞綱2被命名為“CandidatusAccumulibacter phosphatis”，并簡稱為“Accumulibacter”^[9]。研究人員報道了幾種FISH探針根據(jù)16SrRNA上不同區(qū)域來鑒定Accumulibacter^[9-10]。本文對EBPR系統(tǒng)中PAOs的常用探針總結如表1所示。

研究者通過FISH發(fā)現(xiàn)Accumulibacter均大量富集于實驗室規(guī)模的EBPR系統(tǒng)中，其豐度高達55%～95%^[10-11]。然而，在實際污水處理廠中，由于進水水質(zhì)差異較大，導致其微生物種群結構也存在明顯差異。Saunders等^[15]對澳大利亞污水處理廠的研究發(fā)現(xiàn)，Accumulibacter在污水處理廠污泥微生物中同樣具有相當高的豐度（占細菌總數(shù)的4%～22%），且EBPR系統(tǒng)除磷性能與污泥中Accumulibacter比例呈正相關。然而，部分研究者研究表明，Accumulibacter菌群中并非所有與FISH探針結合的細胞都能觀察到貯存有poly-P^[16-17]。Stokholm-Bjerregaard等^[18]對丹麥的18個全規(guī)模污水處理廠微生物種群結構進行評價，發(fā)現(xiàn)Tetrasphaera也是一種常見的PAOs，且具有較高豐度（8.9%）。同時與Accumulibacter菌相比，Tetrasphaera有更多的生理學功能，包括厭氧發(fā)酵和累積發(fā)酵副產(chǎn)物和氨基酸等。此外，雖然Actinobacteria菌生理性狀與大多數(shù)PAOs生化模型描述的性狀存在較大差異，但Actinobacteria菌也能夠在好氧階段超量吸磷并實現(xiàn)良好的除磷性能，是一種潛在的PAOs。為此，Wong等^[19]用特定菌群探針研究測定污泥菌群種類，結果表明：β-變形菌是所研究的特定菌群中的主導PAOs菌群，而Actinobacteria、α-變形菌和γ-變形菌豐度較低。

2? Accumulibacter進化枝的鑒別及分布特征

如前所述經(jīng)大量研究報道，Accumulibacter是EBPR中的優(yōu)勢PAOs。McMahon等^[20]在2002年首次利用PCR分析實驗室規(guī)模SBR反應器中微生物的ppk基因。經(jīng)ppk1-PCR擴增實驗發(fā)現(xiàn)Accumulibacter包含兩種類型（Type I型和Type II型）^[21]，Type I型被細分為進化枝IA～ IE。Type II型被細分為進化枝IIA～ II-G。后來He等^[21]利用實時定量聚合酶鏈反應（qPCR）來鑒別Accumuli-bacter進化枝，研究者利用系列引物并采用宏基因分析對污水處理廠污泥種群結構進行測定，所用引物如表2所示。

然而后來的大量研究表明，在不同的污水處理廠或者實驗室規(guī)模的反應器條件下，不同外界條件的EBPR系統(tǒng)中占主導地位的Accumulibacter分支種類和數(shù)量也不同。Slater等^[22]發(fā)現(xiàn)良好的EBPR性能與進化枝IA有關，而進化枝IIC導致EBPR惡化，同時指出，進化枝IIF屬于進化枝IIC。采用定量ppk1-PCR技術對丹麥28家污水處理廠中的Accumulibacter種群結構進行分析，結果發(fā)現(xiàn)幾乎所有污水處理廠都存在Accumulibacter Type IA和Type IIC，而僅在少數(shù)污水處理廠存在Type IIA 和 Type IID^[23]。由于操作運行條件和廢水水質(zhì)成分的復雜性，全規(guī)模污水處理廠中Accumulibacter進化枝種群結構與實驗室規(guī)模EBPR系統(tǒng)相比明顯不同。有研究發(fā)現(xiàn)，進化枝IA、IC、IIA和IID是實驗室規(guī)模反應器的優(yōu)勢Accumulibacter。Kim 等^[24]發(fā)現(xiàn)，與Type I型相比，實驗室規(guī)模反應器中進化枝IIC只占很小的百分比，與之相反，進化枝IIC在污水處理廠廣泛存在，甚至是優(yōu)勢微生物菌種。Zeng

等^[25]采用ppk1基因作為系統(tǒng)發(fā)育標記研究了Accumulibacter的群落結構、豐度與北京四個代表性污水處理廠（WWTPs）操作運行的相關性，研究發(fā)現(xiàn)EBPR過程中存在有Accumulibacter的5個進化枝（IA、IIA、IIB、IIC和IID）。進化枝IIC占有最大比例，進化枝IIC和IIF存在緊密的遺傳關系。上述結論與Slater等^[22]和 Kim 等 ^[24]的結論一致。通過上述研究發(fā)現(xiàn)我們可以得出結論，實驗室規(guī)模EBPR和實際污水處理廠的Accumulibacter在進化枝水平上的種群結構明顯不同并且污水處理廠的Accumulibacter主要與Type II型有關，然而，進化枝多樣性與運行條件的相關性尚不清楚。

近年來，研究者開展了Accumulibacter進化枝多樣性與EBPR系統(tǒng)操作運行條件的相關性的研究。此外，揮發(fā)性脂肪酸（VFA）、COD/P比、溶解氧（DO）濃度與地理區(qū)域等因素似乎也會影響Accumulibacter的豐度與種群結構^[26]。迄今為止，Accumulibacter表現(xiàn)出的種群結構變化主要控制因素在很大程度上尚不清楚。上述內(nèi)容需要進一步研究。

3 ?Accumulibacter各進化枝的代謝特性

3.1? 對碳源的選擇性

在實際的EBPR過程中，廢水中存在不同的碳源類型會影響聚磷菌的種群結構，從而影響EBPR的性能。在絕大多數(shù)實驗室規(guī)模的EBPR采用揮發(fā)性脂肪酸-VFAs（乙酸或丙酸）作為碳源，因為在實際污水中VFAs是占較大比例，并且VFAs對EBPR具有促進作用。Qiu等^[27]對新加坡三個具有EBPR性能的全規(guī)模污水處理廠的活性污泥進行取樣然后采用5類29種有機化合物作為碳源進行培養(yǎng)比較（4種糖、3種醇、3種揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）、8種氨基酸和6種其他羧酸），結果發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）能夠誘導最大的厭氧釋磷量（乙酸為12.0～18.2 mgP·g^-1MLSS、丙酸為9.4～18.5 mg P·g^-1 MLSS），這也證明了選擇VFAs作為碳源能夠對EBPR產(chǎn)生促進作用。

Martin等^[28]對EBPR系統(tǒng)中微生物的酶及代謝途徑進行了詳細的研究 ， 結果發(fā)現(xiàn)不同的碳源可能導致 PAOs在亞種上存在差異， 而且代謝途徑可能也會受到影響。Nan Shen等^[29]在30 ℃條件下分別用乙酸和丙酸作為碳源運行兩個SBR，結果發(fā)現(xiàn)在兩個反應器中TypeⅡC是優(yōu)勢進化枝。A.B.Lanham等^[30]以丙酸為碳源下運行SBR，可富集到大量Type Ⅰ型Accumulibacter，幾乎沒有Type Ⅱ型。Brenda^[31]等采用乙酸作為碳源并調(diào)整進水P/C比例，結果發(fā)現(xiàn)長期運行的PAO培養(yǎng)物中PAO Type I型成為了優(yōu)勢進化枝。而當L.Welles等^[32]分別運行3個SBR，第一個SBR用乙酸和丙酸作混合碳源，結果發(fā)現(xiàn)均包含Type I和Type II型Accumulibacter。另外兩個SBR反應器以乙酸為碳源并調(diào)整進水P/C，發(fā)現(xiàn)Type I型和 Type Ⅱ型Accumulibacter分別在兩個反應器中占主導地位。Saad 等^[33]以乙酸∶丙酸為3∶1 作為混合碳源的條件下，成功地將Type IC富集至 99%，而沒有觀察到 Type II型或聚糖菌（GAO）。并且Camejo等^[34]在厭氧-微好氧模式下以乙酸為碳源，也成功地富集到Type IC（占Accumulibacter的99%）。然而，Carvalhod等^[35]發(fā)現(xiàn)，將A/O（厭氧/好氧）變?yōu)锳/A（厭氧/缺氧）系統(tǒng)，并用丙酸代替乙酸作為碳源，更有利于缺氧吸磷過程，研究者認為這是由于以丙酸為碳源Type I型更傾向于較Type Ⅱ型取得競爭優(yōu)勢。

以上結果說明，以丙酸為碳源時Type I型似乎更傾向于成為EBPR系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌種，而以乙酸為碳源時Type I型和Type Ⅱ型都有可能成為系統(tǒng)的優(yōu)勢菌種。然而，對于上述研究者的研究結果又啟示我們：雖然不同的進化枝對碳源的選擇性不同，而一些其他因素（比如P/C比、碳源比例、工藝流程、溫度等）對Accumulibacter群落結構也可能起著決定性的作用。這或許能夠解釋為什么不同的研究者在同樣的碳源條件下檢測出的優(yōu)勢Accumulibacter分支不同。所以研究者們還需進一步深入研究完善其他因素對于Accumulibacter進化枝對碳源的選擇性的影響作用。而Carvalhod的研究結果又給優(yōu)化Accumu-libacter種群結構和提高EBPR性能和提供了新的研究思路。

3.2? 溫度的影響

大量的研究報道，溫度是影響EBPR除磷效果的關鍵因素，且就目前已有的研究結果來看，由于低溫能夠抑制GAOs的生長，研究者們對低溫（5～20 ℃）有利于PAOs的生長并能夠提高EBPR的除磷效果已經(jīng)達成了共識^[36-38]。Tian等^[37]采用10℃和16天SRT的條件研究發(fā)現(xiàn)，Type I型Accumulibacter是占主體PAOs，而GAOs受到了抑制。相關研究也印證了低溫有利于PAOs，當溫度高于30 ℃，除P效率大幅度降低^{[25，39-40]}。在低溫下運行的EBPR系統(tǒng)（季節(jié)性）穩(wěn)定性和P去除效率是非常有價值的（例如在冬季或北方國家，其平均年溫度往往低于15 ℃）。然而，由于該實踐可能涉及的相當高的能量成本，人工降低當前實際或全規(guī)模應用中的溫度似乎不可行。所以對于夏季或熱帶國家溫度在25 ℃甚至更高的條件下，EBPR仍然是這些地區(qū)的污水處理廠除磷采取的主要工藝，所以研究EBPR在高溫下的穩(wěn)定運行是非常有必要性的。

Flowers等^[41]研究發(fā)現(xiàn)進化枝IIA的豐度與溫度變化呈正相關性，而進化枝IA與溫度變化呈負相關性。Ong等^[26]采用兩組SBR反應器先后在24、28和32 ℃的溫度下運行，并采用FISH探針和qPCR分別描述PAO種群數(shù)量和PAOs種群動態(tài)，結果發(fā)現(xiàn)，IIF是高溫條件下EBPR系統(tǒng)中的主要進化枝。其中當反應器穩(wěn)定運行后Accumulibacter豐度在24 ℃時為51%，在28 ℃時為33%，在32 ℃時為12%，雖然溫度升高與PAO的增殖呈負相關，然而他們發(fā)現(xiàn)三種溫度下的除磷效果均為95%～99%，這說明僅從PAO的豐度來揭示EBPR的穩(wěn)定性可能并不全面，需要更深入的探討溫度對EBPR穩(wěn)定性的影響機制。然而，Nan Shen等^[29]指出在30 ℃的條件下分別用乙酸和丙酸運行兩個反應器并利用qPCR檢測Accumulibacter支系的豐度，結果發(fā)現(xiàn)在兩個反應器中IIC進化枝均為優(yōu)勢進化枝，這與Zeng^[25]對實際的污水處理廠取樣結果一致。然而，這個結果與Ong等^[26]的研究結果相沖突，說明在高溫條件下的EBPR中的Accumulibacter優(yōu)勢進化枝還需進一步研究確定。值得注意的是，在Nan Shen等^[30]的研究中觀察到呼吸硝酸鹽的減少，硝酸鹽的存在可能在一定程度上改變Accumulibacter種群結構。

3.3? 電子受體的影響

具有反硝化除磷功能的聚磷菌一般被研究者統(tǒng)稱為DPAOs，在對PAOs的研究初期，有研究者認為DPAOs和PAOs分別是兩種不同的微生物^[42-43]。但隨著Accumulibacter是EBPR系統(tǒng)中的主導PAOs所形成共識以及發(fā)現(xiàn)Accumulibacter進化枝也具有反硝化除磷功能，于是有Carvalhod^[35]提出DPAOs和PAOs都屬于Accumulibacter，本節(jié)也基于這樣的觀點，著重討論電子受體對Accumulibacter進化枝群落結構的影響。

Oehmen^[4]等認為Type I型Accumulibacter可以利用硝酸鹽（NO₃^--N）和亞硝酸鹽（NO₂^--N）為電子受體進行反硝化吸磷，但Type II型只能利用亞硝酸鹽為電子受體進行反硝化吸磷。進一步研究發(fā)現(xiàn)進化枝IA能利用硝酸鹽為電子受體吸收P，而進化枝IIA只能利用亞硝酸鹽^[13]。García等^[44]通過宏基因組學研究認為Type II型缺少硝酸鹽還原酶（nar），這似乎是上述Type I型和Type II型不同區(qū)別的原因

然而，李博曉^[45]的研究結果與上述原因有不一致的地方，他采用硝酸鹽（NO₃^--N）、亞硝酸鹽（NO₂^--N）作為單一電子受體并且采用乙酸和丙酸作為碳源分別運行4組SBR反應器，從反應器開始運行至運行穩(wěn)定期間采用qPCR定量分析并監(jiān)測反應器的菌群變化。SBR1運行條件為乙酸、NO₃^--N，結果發(fā)現(xiàn)Type I型的比例增速最快。SBR2運行條件為丙酸、NO₃^--N，結果發(fā)現(xiàn)PAOs的總比例有很大提升，這也證明了對于Accumulibacter的富集丙酸作為碳源更有優(yōu)勢，而Type I型的比例一直降低，Type II D的比例卻一直升高。SBR3運行條件為乙酸、NO₂^--N，結果發(fā)現(xiàn)Type I型和Type IIA的比例先快速上升然后降低，進化枝IIB的數(shù)量增加但其所占比例卻降低，進化枝IID的比例卻一直升高。SBR4運行條件為丙酸和NO₂^--N，結果發(fā)現(xiàn)Type I型大幅增加，隨后EBPR性能惡化。采用硝酸鹽作為電子受體似乎有利于Type I型較Type II型取得競爭優(yōu)勢，但在大多數(shù)情況下，它們傾向共存于EBPR系統(tǒng)中。然而值得注意的是4組反應器進化枝IID雖然比例有所波動但一直都是比例最高的菌種，SBR3和SBR4中IIC均被淘汰。上訴結果這說明不能簡單地以Type I和Type II類型來判斷Accumulibacter進化枝對電子受體的選擇性，其他影響因素（比如碳源、溫度等）也可能起著決定性的作用。

4? 存在的問題和展望

本綜述簡要總結了聚磷菌的分類及Accumulibacter進化枝的鑒別和從碳源、溫度和電子受體三個方面闡述了Accumulibacter進化枝的代謝特性及種群變化。然而，目前就對Accumulibacter進化枝的代謝特性和種群變化的認知還存在缺陷，在進化枝層面的影響因素的研究還不夠完善，特別是在多因素的條件下，群落結構會受到較大影響，同時檢測手段也限制了對Accumulibacter進化枝的進一步認識。

為了更好的理解Accumulibacter進化枝的代謝特性，進一步完善和提高EBPR性能，在未來還需要進一步完善在多因素條件下種群結構的變化研究以及在分子水平上深入研究進化枝的代謝活動和種群結構的動態(tài)變化。

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基金項目：國家自然科學基金（項目編號：21577174）;重慶市基礎科學與前沿技術研究專項（項目編號：CSTC2015jcyjBX0012、CSTC2014jcyjA20004、CSTC2015jcyjA1286）。

收稿日期：2019-10-16

作者簡介：謝朝新（1968-），男，博士，教授，主要從事環(huán)境工程教學科研工作。E-mail：a86909304@163.com。

通訊作者：龍向宇（1979-），男，博士，副教授，致力于廢水處理理論與技術研究。E-mail：2002longxy@sina.com。