李莉，魯嘉，李卉卉，楊小弟

(1.江蘇大學(xué)分析測(cè)試中心，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230000；3.江蘇省生物醫(yī)藥功能材料協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省新型動(dòng)力電池重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省生物功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，南京 210097)

雙酚A(BPA)是一種已知的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，是重要的化工原料，主要用于生產(chǎn)增塑劑、阻燃劑等精細(xì)化工產(chǎn)品，其應(yīng)用涉及食品包裝到醫(yī)療器械等，由于其應(yīng)用廣泛，對(duì)人類(lèi)的危害不容忽視［1］。

腫瘤的產(chǎn)生通常源于人體內(nèi)癌基因或腫瘤抑制基因的異常表達(dá)。C-myc基因［2］是基礎(chǔ)研究中涉及最廣泛的癌基因之一，在多種人類(lèi)腫瘤中都存在異常表達(dá)現(xiàn)象；p53基因［3–4］是人類(lèi)最主要的腫瘤抑制基因，能阻止多種腫瘤生長(zhǎng)，其自身結(jié)構(gòu)的改變是其抑癌功能喪失的主要原因。尚未見(jiàn)研究這兩種DNA關(guān)鍵片段與一些環(huán)境內(nèi)分泌干擾物間作用機(jī)制的報(bào)道。

筆者通過(guò)多種光譜方法和凝膠電泳技術(shù)研究BPA與兩種人類(lèi)腫瘤相關(guān)DNA的相互作用，旨在從分子水平上考察BPA與此類(lèi)DNA分子間的作用機(jī)制，也為從化學(xué)生物學(xué)角度研究腫瘤與環(huán)境內(nèi)分泌干擾物間的關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

電導(dǎo)率／離子綜合測(cè)試儀：SevenMulti pH型，瑞士Mettler Toledo公司；

低溫恒溫槽：DC–1006型，中國(guó)寧波新芝生物技術(shù)有限公司；

數(shù)顯式恒溫水浴鍋：HH–2型，中國(guó)常州國(guó)華電器有限公司；

紫外分光光度計(jì)：Cary-5000型，美國(guó)Varian公司；

熒光光度計(jì)：LS50B 型，美國(guó)Perkin Elmer公司；

數(shù)字式圓二色譜儀：Chirascan型，英國(guó)Applied Photophysics公司；

電泳儀：PROTEAN II xi Cell型，美國(guó)Bio-Rad公司；

凝膠成像儀：GelDoc-It型，美國(guó)UVP公司；

單 鏈DNA：(1)p53基 因P1啟 動(dòng) 子區(qū)(ss1：5’-CCTCCTCCCCAACTCC-3’，ss2：3’-GGAGGAGGGGTTGAGG-5’)，(2)C-myc基因啟動(dòng)子NHE III1元件區(qū)(ss1：5’-GGGAGGGTGGGGAAGG-3’，ss2：3’-CCCTCCCACCCCTTCC-5’)，上海生工生物技術(shù)有限公司；

溴化乙錠(EB)：純度大于98%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

雙酚A(BPA)標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于99.9%，美國(guó)Accu Standard公司；

其它試劑均為分析純；

實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 雙鏈DNA的制備

等量混合2條互補(bǔ)單鏈DNA溶液(500 μmol／L)，由室溫升至85℃保持10 min退火，緩慢自然冷卻至室溫(超過(guò)4 h)，即得雙鏈DNA溶液［5］。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紫外滴定實(shí)驗(yàn)

在DNA 溶液中逐步滴加BPA溶液，使BPA與DNA的摩爾比從0∶1到5∶1，測(cè)量DNA溶液紫外吸收光譜的變化。

1.3.2 紫外升溫實(shí)驗(yàn)

在生理溫度37℃下恒溫24 h后進(jìn)行25～90℃程序升溫，測(cè)量不同溫度下DNA及DNA與BPA以摩爾比為1∶1混合后于260 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化趨勢(shì)［6］。

1.3.3 熒光滴定實(shí)驗(yàn)

在BPA溶液中逐步滴加DNA溶液，使DNA與BPA的摩爾比從0∶1到10∶1，以270 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量BPA熒光光譜的變化。

1.3.4 EB–DNA競(jìng)爭(zhēng)猝滅實(shí)驗(yàn)

配制摩爾比為1∶10的EB–DNA混合溶液，逐步滴加BPA溶液，使BPA與DNA的比例從0∶1到20∶1，以480 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量EB–DNA體系的熒光變化。

1.3.5 離子強(qiáng)度影響實(shí)驗(yàn)

配制摩爾比為1∶10∶100的DNA–EB–NaCl混合溶液，依次滴加BPA溶液，使BPA與DNA的摩爾比從0∶1到20∶1，以480 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量DNA–EB–NaCl溶液的熒光變化。

1.3.6 KI猝滅對(duì)比實(shí)驗(yàn)

在BPA溶液和BPA–DNA的混合溶液中均依次滴加KI溶液，使KI與BPA的摩爾比從0∶1到20∶1，以270 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量?jī)煞N情況下BPA熒光光譜的變化。

1.3.7 圓二色光譜實(shí)驗(yàn)

在DNA 溶液中逐步滴加BPA溶液，使BPA與DNA摩爾比從0∶1到20∶1，測(cè)量BPA對(duì)DNA 圓二色光譜的影響。

1.3.8 聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

現(xiàn)配20%的聚丙烯酰胺膠成型預(yù)電泳0.5 h后進(jìn)行上樣，正式電泳12 h后由SYBR Green I染色，經(jīng)凝膠成像儀拍照觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外滴定實(shí)驗(yàn)

向DNA溶液中逐步加入BPA溶液，觀測(cè)DNA在260 nm處特征峰的變化情況，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 BPA與DNA混合后溶液的紫外吸收?qǐng)D譜

由圖2可知，DNA特征峰出現(xiàn)減色現(xiàn)象，且當(dāng)BPA濃度較大時(shí)，出現(xiàn)了明顯的紅移現(xiàn)象。若DNA特征峰出現(xiàn)減色和紅移現(xiàn)象則表明分子軸向變化即構(gòu)象變化［7］，這表明BPA與DNA間存在嵌插作用，BPA的類(lèi)平面結(jié)構(gòu)可插入DNA堿基對(duì)之間，因此影響了DNA雙螺旋固有結(jié)構(gòu)。

2.2 紫外升溫實(shí)驗(yàn)

DNA雙鏈在260 nm處有特征吸收峰，當(dāng)雙螺旋結(jié)構(gòu)改變或解鏈時(shí)則會(huì)出現(xiàn)增色現(xiàn)象，把處于最高吸光度與最低吸光度的中間值所對(duì)應(yīng)的溫度作為解鏈溫度Tm。在相同條件下，測(cè)量純DNA和小分子與DNA混合溶液的解鏈溫度，結(jié)果列于表1。

表1 BPA加入前后DNA的解鏈溫度值

由表1中數(shù)據(jù)看出，當(dāng)向DNA中加入BPA后，解鏈溫度均上升了，說(shuō)明BPA分子插入DNA堿基對(duì)中使雙鏈堿基之間結(jié)構(gòu)排列緊密，因此更難解鏈。此外C-myc DNA的溫度升高明顯是因?yàn)镃-myc DNA比p53 DNA含有更高含量的G–C序列，更適于嵌插作用的形成。

2.3 熒光滴定實(shí)驗(yàn)

BPA分子由于本身固有的類(lèi)平面結(jié)構(gòu)而具有固有熒光。向BPA溶液中逐步滴加DNA，記錄BPA熒光峰強(qiáng)度的變化，實(shí)驗(yàn)圖譜見(jiàn)圖3。

圖3 BPA與DNA混合后溶液的熒光光譜

由圖3可知，當(dāng)加入DNA后，譜線(xiàn)峰形略微改變，表明DNA與BPA反應(yīng)結(jié)合成新的化合物，繼續(xù)加入DNA后譜線(xiàn)出現(xiàn)猝滅現(xiàn)象，證實(shí)了DNA與BPA存在相互作用［8］。

2.4 EB–DNA競(jìng)爭(zhēng)猝滅實(shí)驗(yàn)

溴化乙錠(EB)是常見(jiàn)的DNA嵌插劑，純DNA無(wú)明顯的熒光現(xiàn)象，而當(dāng)DNA與EB嵌插時(shí)則有強(qiáng)熒光峰，因此EB常被用于研究小分子與DNA嵌插作用的參照物。向DNA–EB混合體系中加入小分子，若使體系熒光猝滅則表明小分子競(jìng)爭(zhēng)了EB的嵌插作用，即證明小分子與DNA間有嵌插作用［9］。按1.3.4進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄DNA–EB體系的熒光變化，結(jié)果見(jiàn)表2。當(dāng)BPA與DNA摩爾比達(dá)到10∶1時(shí)，體系的猝滅程度達(dá)到了20%左右，表明BPA與DNA中存在明顯的嵌插作用。

2.5 離子強(qiáng)度影響實(shí)驗(yàn)

NaCl可用于控制溶液的離子強(qiáng)度，可電離出相當(dāng)濃度的陰陽(yáng)離子。DNA鏈由磷酸骨架構(gòu)成，表面帶有負(fù)電荷，因此NaCl溶液中DNA表面可與陽(yáng)離子發(fā)生無(wú)特異性的靜電結(jié)合。按1.3.5進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，與上述EB–DNA競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)作對(duì)比，對(duì)比結(jié)果列于表2。若與2.4中實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)差異則表明NaCl的存在影響了原有的相互作用，進(jìn)一步表明小分子和DNA間還存在靜電作用［10］。由表2可知，當(dāng)有NaCl存在時(shí)，BPA使DNA–EB體系的猝滅程度明顯降低。表明NaCl的存在競(jìng)爭(zhēng)了BPA與DNA原有的相互作用，即說(shuō)明BPA與DNA間存在靜電作用。

表2 NaCl對(duì)BPA與EB–DNA體系作用的影響結(jié)果

2.6 KI猝滅對(duì)比實(shí)驗(yàn)

I–是典型的陰離子猝滅劑，可猝滅熒光物質(zhì)的固有熒光，也可與小分子–DNA二元體系形成混合體系用于研究DNA與小分子間的相互作用。當(dāng)小分子與DNA以嵌插或靜電作用結(jié)合時(shí)，I–受堿基對(duì)或磷酸骨架的保護(hù)，降低原有的熒光猝滅程度，而當(dāng)DNA與小分子為溝槽作用時(shí)，則猝滅程度會(huì)升高［11］。圖4分別為KI猝滅BPA譜線(xiàn)和p53 DNA和C-myc DNA存在時(shí)KI猝滅BPA譜線(xiàn)。

圖4 BPA與KI溶液猝滅對(duì)比圖譜

由圖4可知，當(dāng)DNA存在時(shí)猝滅程度明顯降低，進(jìn)一步證明BPA與DNA間為嵌插和靜電作用。

2.7 圓二色滴定實(shí)驗(yàn)

DNA圓二色光譜是研究其構(gòu)象變化準(zhǔn)確又快速的方法，當(dāng)藥物或毒物與DNA發(fā)生各類(lèi)作用時(shí)，在圓二色圖譜上會(huì)反映出變化。DNA雙鏈在245 nm處的負(fù)峰歸屬于DNA的B型構(gòu)象，260～280 nm處的正峰歸屬于堿基堆積作用，若出現(xiàn)正峰上升和負(fù)峰降低現(xiàn)象則表明存在嵌插作用。向DNA溶液中逐步滴加BPA溶液，BPA與2種DNA作用圖譜見(jiàn)圖5。圖5中DNA正負(fù)峰均出現(xiàn)了一定程度的降低或升高，表明嵌插作用的存在，而B(niǎo)PA使C-myc DNA負(fù)峰上升程度更明顯，這可能是2種DNA序列差異造成，C-myc DNA比p53 DNA含有更高含量的G–C序列，更適于嵌插作用的形成［12］。

圖5 BPA與DNA混合后的圓二色光譜圖

2.8 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)常用于生物大分子的分離和純化，不同相對(duì)分子質(zhì)量和不同構(gòu)象的DNA由于遷移率不同在電泳圖中表現(xiàn)為不同的條帶［13］。圖6中1～4泳道分別為16bp的雙鏈p53 DNA片段以及與BPA以不同摩爾比混合溶液的電泳條帶。從圖6中可看出，隨著B(niǎo)PA與DNA摩爾比不斷加大，DNA雙鏈條帶逐漸變淡且條帶遷移率略減小，結(jié)合光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推斷出一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)論：嵌插作用可改變DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，使相對(duì)分子質(zhì)量增大從而減小遷移率，而靜電作用可中和DNA磷酸骨架的負(fù)電荷從而也能減小遷移率，因此該實(shí)驗(yàn)佐證了嵌插和靜電作用。

圖6 BPA與p53 DNA相互作用的凝膠電泳圖譜

3 結(jié)論

據(jù)相關(guān)研究，平面不飽和環(huán)結(jié)構(gòu)與生色團(tuán)堿基側(cè)鏈可以一起插入DNA堿基對(duì)中［14］，BPA符合此類(lèi)結(jié)構(gòu)。BPA與腫瘤相關(guān)DNA的作用為嵌插和靜電作用，使紫外實(shí)驗(yàn)中DNA呈現(xiàn)減色和紅移現(xiàn)象；紫外升溫實(shí)驗(yàn)中BPA由于嵌插入DNA堿基對(duì)中增加了堿基的緊密度從而使解鏈溫度上升；EB競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)和圓二色滴定實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了嵌插作用；離子強(qiáng)度對(duì)比實(shí)驗(yàn)則證實(shí)了靜電作用；電泳實(shí)驗(yàn)佐證了BPA與DNA間的嵌插和靜電雙重作用使DNA遷移率降低并使DNA雙鏈含量減少。綜上所述，BPA與DNA的結(jié)合可影響DNA的雙螺旋構(gòu)象，在分子水平上為BPA對(duì)人體內(nèi)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)影響提供理論基礎(chǔ)。

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