王藝璇，王 可，張 舒

空軍軍醫(yī)大學(xué) 航空航天生物動力學(xué)教研室，航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，陜西西安 710032

骨骼是一個極其特殊和充滿活力的器官，骨重建存在于人的一生，是正常成人骨代謝的主要方式，對骨內(nèi)環(huán)境保持穩(wěn)定至關(guān)重要。骨重建是修復(fù)因日常體力負(fù)荷而造成的陳舊性骨損傷，預(yù)防衰老效應(yīng)及其后果的重要手段。骨重建包括骨吸收及骨形成兩個階段，這兩個階段的平衡對于維持骨量和全身礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。骨重建過程中骨吸收增加、骨形成減少，常引發(fā)骨質(zhì)丟失，甚至造成骨質(zhì)疏松[1]。微重力導(dǎo)致的骨質(zhì)丟失是限制中長期載人航天任務(wù)和火星探險活動的最主要因素之一。航天員長時間停留于太空中，微重力環(huán)境中骨骼受到的力學(xué)刺激減少，打破了骨重建過程中骨吸收與骨形成之間的平衡，導(dǎo)致骨量以平均每個月1% ～ 2%的速率丟失。目前的藥物治療、體育鍛煉尚不能有效阻止骨質(zhì)的持續(xù)丟失[2]。航天飛行及地面模擬微重力實驗(如人體臥床實驗、動物尾吊模型及細(xì)胞回轉(zhuǎn)等)均可用于研究機械刺激對骨重建的影響。本文就近年來關(guān)于微重力影響骨重建的細(xì)胞和分子機制研究進行綜述。

1 骨重建概述

生理性骨重建是一個高度協(xié)調(diào)的過程，是多種骨組織細(xì)胞(包括破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和免疫細(xì)胞等)共同作用下舊骨吸收、新骨形成的骨組織自我更新，是修復(fù)受損骨和維持礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)所必需的過程。骨重建發(fā)生在數(shù)周內(nèi)，由排列在被稱為“基本多細(xì)胞單元”(basic multicellular unit，BMU)的臨時解剖結(jié)構(gòu)內(nèi)的破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞等動態(tài)耦聯(lián)完成。每一個完整的BMU 都由骨內(nèi)襯細(xì)胞包裹形成骨重建室，前方由一組破骨細(xì)胞溶解吸收骨組織，而成骨細(xì)胞跟隨其后，不斷分泌和沉積未礦化的膠原成骨以填充骨吸收后留下的空間。BMU 內(nèi)細(xì)胞這種獨特的空間和時間排列，為耦合的骨吸收-骨形成創(chuàng)造了一個獨特的微環(huán)境，保證了骨重建五個連續(xù)階段—激活、吸收、逆轉(zhuǎn)、形成和終止的協(xié)調(diào)[3-4]。

激活期是骨重建的第一階段。骨骼在此之前處于靜止?fàn)顟B(tài)，檢測到初始的重塑信號，如機械刺激或激素水平改變(如雌激素或甲狀旁腺激素)[5-6]。對骨骼造成機械應(yīng)變或微損傷的力學(xué)信號可以被轉(zhuǎn)換為能夠由骨細(xì)胞感知的生物信號[6-7]。破骨前體細(xì)胞隨之被招募到需要骨重建的部位，啟動骨重建。骨吸收期主要由破骨細(xì)胞所介導(dǎo)，成熟的破骨細(xì)胞形成后可產(chǎn)生αVβ3整合素分子，分泌組織蛋白酶K 等溶酶體酶消化有機骨基質(zhì)，同時骨組織局部微環(huán)境中pH 值降低，無機礦物質(zhì)溶解，形成骨吸收陷窩[8]。骨吸收后，空腔中含有多種細(xì)胞，包括單核細(xì)胞和骨細(xì)胞等。骨陷窩由富含糖蛋白和酸性磷酸成分的黏性物質(zhì)沉積填平，但缺乏膠原成分的沉積。然而逆轉(zhuǎn)期中骨吸收結(jié)束和骨形成開始的耦合信號尚不十分清楚。目前研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子-β 含量與骨轉(zhuǎn)換率有關(guān)，其可抑制成骨細(xì)胞產(chǎn)生NF-κB 受體激活蛋白配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)， 從而減少破骨細(xì)胞的吸收[9]。之后破骨細(xì)胞逐漸被成骨細(xì)胞所取代，進入由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成期。成骨細(xì)胞合成分泌Ⅰ型膠原蛋白(type Ⅰcollagen，Col Ⅰ)等有機成分，產(chǎn)生大量的骨質(zhì)特異性堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)，細(xì)胞外基質(zhì)逐漸成熟[10]。隨著新骨基質(zhì)礦化，羥基磷灰石晶體被整合到新沉積的類骨中以進行骨質(zhì)礦化。成骨細(xì)胞一部分繼續(xù)形成新骨，直到它們轉(zhuǎn)化為完全覆蓋新形成骨表面的靜止骨襯里細(xì)胞；另一些成骨細(xì)胞則被埋入新形成的骨基質(zhì)中，成為骨細(xì)胞，其廣泛的小管網(wǎng)絡(luò)將其與骨表面襯里細(xì)胞、成骨細(xì)胞和其他骨細(xì)胞連接起來。單個骨重建單位完成上述階段的改建過程后，暫時進入終止期，直到下一波骨重建開始。

2 微重力對骨組織細(xì)胞的影響

2.1 微重力對破骨細(xì)胞的影響 破骨細(xì)胞是大的多核巨細(xì)胞，來源于骨髓造血干細(xì)胞，由單核-巨噬細(xì)胞系的單核前體細(xì)胞分化而來，是目前唯一已知的能夠吸收骨的細(xì)胞。骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞所分泌的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、RANKL 和骨保護素等細(xì)胞因子，對破骨細(xì)胞前體在體外和體內(nèi)的存活、增殖和分化至關(guān)重要[11]。破骨細(xì)胞功能增強在微重力導(dǎo)致的骨質(zhì)丟失中起著十分重要的作用[12]。航天飛行研究發(fā)現(xiàn)，微重力可增強破骨細(xì)胞骨吸收陷窩的形成，骨載玻片的總吸收面積同樣顯著增大[13]。歐洲航天局福田M3 航天飛行任務(wù)研究發(fā)現(xiàn)，與地面對照組相比，微重力環(huán)境中破骨細(xì)胞成熟和活性相關(guān)的基因表達(dá)增加，骨吸收能力增強[14]。國際空間站研究同樣證實，微重力可激活破骨細(xì)胞[15]。SD 大鼠尾吊4 周后，血清中骨堿性磷酸酶與耐酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)升高，提示骨吸收能力增強[16]。Saxena 等[17]發(fā)現(xiàn)小鼠尾吊后肢去負(fù)荷28 d 后，其骨髓巨噬細(xì)胞在RANKL 和M-CSF誘導(dǎo)刺激后產(chǎn)生的TRAP 陽性多核破骨細(xì)胞數(shù)量增加。旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)雖不能誘導(dǎo)RAW 264.7 破骨前體細(xì)胞生成，但破骨細(xì)胞生成相關(guān)的信號分子發(fā)生活化，TRAP 陽性多核破骨細(xì)胞增多，破骨細(xì)胞標(biāo)記基因TRAP 和組織蛋白酶K 表達(dá)增加[17]。Sambandam 等[18]研究發(fā)現(xiàn)小鼠RAW 264.7 細(xì)胞在使用旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)后破骨分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如c-Jun 氨基末端激酶和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞質(zhì)中鈣離子水平及鈣振蕩增加。使用旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)模擬微重力培養(yǎng)小鼠骨髓后，自噬標(biāo)志物Atg5 和LC3-Ⅱ的表達(dá)以及自噬體的形成顯著增加，破骨細(xì)胞生成增多[19]。此外利用隨機定位儀模擬微重力培養(yǎng)FLG 29.1 人前破骨細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨架改變、凋亡增加，而存活的RANK 及其配體RANKL 表達(dá)增加、破骨細(xì)胞分化增強[20]。

2.2 微重力對成骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響 成骨細(xì)胞屬于成纖維樣細(xì)胞，由間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化而成，是一類特殊的具有成骨潛能的細(xì)胞，其分化過程以成骨細(xì)胞特異基因的順序激活為標(biāo)志。成骨細(xì)胞分化受到runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)和鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子(Osterix)的調(diào)節(jié)，其分化早期即開始合成分泌成骨基質(zhì)主要成分Col Ⅰ和調(diào)節(jié)骨基質(zhì)成熟穩(wěn)定的ALP，而晚期則分泌合成在骨基質(zhì)礦化成熟中起重要作用的骨鈣素[21-22]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白、甲狀旁腺激素、Wnt信號通路等蛋白質(zhì)、激素和信號通路在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化等功能方面同樣發(fā)揮重要作用[23-24]。微重力環(huán)境中成骨細(xì)胞功能會受到抑制[12]。航天飛行時人體血清中骨形成標(biāo)志物—骨堿性磷酸酶及Ⅰ型膠原前肽降低，提示骨形成減少[25]。暴露在航天微重力環(huán)境5 d 后，成骨細(xì)胞局灶性黏附完整性降低，肌動蛋白和應(yīng)力纖維減少，呈現(xiàn)擴散的細(xì)胞形態(tài)[13]。歐洲航天局SpaceX Dragon 航天飛行任務(wù)研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞暴露在微重力環(huán)境14 d 后成骨分化關(guān)鍵因子Runx2、Osterix 和Col ⅠmRNA表達(dá)降低[26]。利用放射性DNA 合成標(biāo)志物研究大鼠尾吊后肢去負(fù)荷4 周后股骨中的成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞分化及向骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化均明顯延緩[27]。多項研究表明微重力環(huán)境中，成骨細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞分化過程均會受到負(fù)面影響，具有成骨功能的細(xì)胞數(shù)量明顯減少[28]。研究表明，成骨細(xì)胞分化各階段中的多個轉(zhuǎn)錄因子及標(biāo)志蛋白，如Runx2、Osterix、Col Ⅰ的表達(dá)在模擬微重力環(huán)境中均明顯降低[29]。Wnt/β-catenin 信號通路在成骨細(xì)胞中發(fā)揮著重要的作用，微重力環(huán)境下成骨細(xì)胞Wnt/β-catenin 信號通路的激活受到抑制，進一步影響了成骨細(xì)胞的增殖與分化功能[30]。非編碼RNA 同樣可以參與骨形成的各個階段，微重力環(huán) 境 下 眾 多microRNAs， 如miR-214、miR-33、miR-139 等，可以通過其各自的靶基因調(diào)控成骨細(xì)胞的功能[29,31-32]。此外，長鏈非編碼RNA，如lncRNA ODSM、OGRU 在微重力環(huán)境中也可通過結(jié)合不同的miRNAs 調(diào)控成骨分化[33-34]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類可自我更新，具有多向分化潛能的干細(xì)胞，可分化為成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞等。如果在骨重建過程中這種分化不平衡，脂肪細(xì)胞數(shù)量增加，成骨細(xì)胞數(shù)量減少，可能會導(dǎo)致骨量減少甚至骨質(zhì)疏松[35]。利用SJ-10 返回式科學(xué)衛(wèi)星的實際微重力環(huán)境，研究空間微重力對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響，發(fā)現(xiàn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞微重力環(huán)境中成骨特異性基因表達(dá)減少，而成脂特異性基因表達(dá)增加[36]。Pan 等[37]研究發(fā)現(xiàn)大鼠尾吊后肢去負(fù)荷28 d 后，尾吊大鼠后肢股骨的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)后成骨標(biāo)記細(xì)胞基因Runx2 表達(dá)減少，成骨潛能降低。模擬微重力可降低MSCs 中Runx2、ALP、Col Ⅰ等成骨分化標(biāo)志基因的表達(dá)[38]。微重力環(huán)境中MAPK、Notch、PPARγ 等信號通路的激活可能是抑制MSCs 向成骨細(xì)胞分化的主要分子機制[39-40]。

2.3 微重力對骨細(xì)胞的影響 骨細(xì)胞是成骨細(xì)胞中無法增殖的終端分化細(xì)胞，占骨骼中所有細(xì)胞的90% ～ 95%，是成熟骨中最常見的細(xì)胞。成骨細(xì)胞在骨形成過程中經(jīng)歷了終末分化，被埋入骨基質(zhì)中成為類骨樣骨細(xì)胞，形成長的樹突狀骨細(xì)胞突起，呈星形樹突狀突起延伸至骨基質(zhì)中的小管，與骨基質(zhì)中的其他骨細(xì)胞或骨表面的成骨細(xì)胞相互作用，從而形成腔隙-小管網(wǎng)絡(luò)。在骨重建過程中骨細(xì)胞可感知機械及代謝信號，并能通過合成一氧化氮和硬化蛋白等調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能[6-7]。微重力導(dǎo)致的骨細(xì)胞功能的改變，可能是微重力影響骨重建的是始動因素。Aguirre 等[41]研究發(fā)現(xiàn)，尾吊后肢去負(fù)荷小鼠骨小梁和皮質(zhì)骨中的骨細(xì)胞凋亡率增加，且凋亡的骨細(xì)胞主要分布在骨內(nèi)膜的皮質(zhì)骨部位，即骨吸收發(fā)生的部位，提示骨細(xì)胞的凋亡可能是啟動破骨細(xì)胞進行骨吸收的重要刺激。此外，模擬微重力可導(dǎo)致骨細(xì)胞(MLOY-4)中連接蛋白Wnt 通路下游靶基因Cycling D1 的mRNA 和蛋白表達(dá)減少，Connexin43 生物功能被破壞，β-catenin 蛋白表達(dá)減少，均提示W(wǎng)nt/β-catenin 信號通路活性明顯下降[42]。同時模擬微重力可使MLOY-4 小鼠骨細(xì)胞膜骨架spectrin 以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上蛋白IP3R 位置分布發(fā)生變化，導(dǎo)致骨細(xì)胞鈣池操縱Ca2+通道(SOC 通道)活性降低[43]。

3 結(jié)語

微重力會影響骨重建的各個階段，促進骨吸收、抑制骨形成，造成機體骨質(zhì)丟失。進一步研究闡明微重力影響骨重建的細(xì)胞和分子機制，探尋其關(guān)鍵通路和靶點，從而建立緩解微重力導(dǎo)致骨質(zhì)丟失的方法，對于我國中長期載人航天任務(wù)及空間站的順利運行十分必要。然而目前仍有一些問題需要解決，如微重力影響骨組織中各細(xì)胞的始動因素及關(guān)鍵分子尚不十分明確，其次缺乏微重力環(huán)境下各種骨組織細(xì)胞相互作用的研究。