譚惠婷，安 敏，李青華，李柳然，張 樺

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 內(nèi)分泌代謝科，廣東廣州 510280

國(guó)際糖尿病聯(lián)盟最新數(shù)據(jù)顯示，2019 年因糖尿病或其并發(fā)癥死亡的人數(shù)約占全球全因死亡人數(shù)的11.3%[1]。其中，糖尿病足是重要原因之一。有學(xué)者估計(jì)，糖尿病患者中糖尿病足潰瘍的患病率高達(dá)19% ～ 34%[2]。糖尿病足潰瘍處理不當(dāng)會(huì)發(fā)展為糖尿病足感染，15%的糖尿病足感染患者由于感染惡化最終不得不截肢[3]。因此對(duì)于糖尿病足患者來(lái)說(shuō)，早期診治、避免感染惡化較為關(guān)鍵。感染控制不徹底主要?dú)w咎于病原微生物鑒定的不足以及缺乏對(duì)微生物群落的全面認(rèn)識(shí)。目前應(yīng)用于糖尿病足感染的病原體鑒定主要包括兩大類—培養(yǎng)法及分子技術(shù)。前者包括傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)及培養(yǎng)組學(xué)，后者主要包括16S rRNA 測(cè)序、宏基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等。本文將對(duì)國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的糖尿病足感染病原體的鑒定技術(shù)進(jìn)行總結(jié)，重點(diǎn)介紹相關(guān)分子技術(shù)及其在指導(dǎo)糖尿病足患者抗感染治療中的優(yōu)勢(shì)。

1 培養(yǎng)法

1.1 微生物培養(yǎng)法 微生物培養(yǎng)法在初步表征糖尿病足感染的微生物學(xué)信息中起到重要作用，此法具有低成本、操作簡(jiǎn)易、技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn)，是目前臨床上研究糖尿病足感染的主流方法。臨床研究顯示糖尿病足感染患者培養(yǎng)出的最常見致病菌是金黃色葡萄球菌[4-5]。一項(xiàng)納入126 名患者的研究共分離出134 種病原體，最常見的兩種菌依次是金黃色葡萄球菌(35%)、銅綠假單胞菌(15.6%)[6]；同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)潰瘍的嚴(yán)重程度可能會(huì)影響培養(yǎng)的結(jié)果，隨著糖尿病足嚴(yán)重程度的增加，革蘭陰性細(xì)菌(尤其是糞腸球菌)的比例也增加。但微生物培養(yǎng)法在一些情況下容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果，如生長(zhǎng)緩慢或培養(yǎng)條件苛刻的致病菌、厭氧菌以及在接受抗生素治療的患者中采樣等[7]。因此不一定能真實(shí)反映出糖尿病足感染的重要生物學(xué)信息或微生物種群的全貌。而且培養(yǎng)法耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，阻礙了敏感抗生素的及時(shí)應(yīng)用，一定程度上影響患者有效治療。

1.2 培養(yǎng)組學(xué) 培養(yǎng)組學(xué)主要使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜以優(yōu)化培養(yǎng)條件，促進(jìn)傳統(tǒng)培養(yǎng)法難以培養(yǎng)的病原體生長(zhǎng)[8]。其通過細(xì)菌蛋白質(zhì)產(chǎn)生獨(dú)特的“質(zhì)譜指紋”來(lái)識(shí)別細(xì)菌的種屬[9]。一項(xiàng)關(guān)于培養(yǎng)組學(xué)的研究顯示，從43 例中重度糖尿病足患者中分離出的需氧菌主要為金黃色葡萄球菌(52.8%)、葡萄球菌(18.7%)、表皮葡萄球菌(11.3%)；厭氧菌主要為糞腸球菌(45.2%)、陰溝腸桿菌(22.6%)、奇異變形桿菌(11.3%)和大芬戈?duì)柕戮?9.4%)，并且88.3%樣品是混合性感染。另外，金黃色葡萄球菌與傷口惡化相關(guān)，但傷口中某些凝固酶陰性葡萄球菌(表皮葡萄球菌、沙門菌)與傷口愈合有關(guān)[10]?？梢娕囵B(yǎng)組學(xué)描繪相當(dāng)豐富的細(xì)菌多樣性，并且加深我們對(duì)細(xì)菌與宿主之間的認(rèn)識(shí)。但此法需要通過質(zhì)譜儀分析較大數(shù)量的新鮮菌落，存在工作量大和無(wú)法進(jìn)行大樣本檢測(cè)的局限性。同時(shí)，由于無(wú)法識(shí)別尚未培養(yǎng)成功的微生物，從而造成一定的假陰性結(jié)果。更重要的是，培養(yǎng)組學(xué)不能像分子技術(shù)那樣直接提供有關(guān)基因表達(dá)和細(xì)菌潛在功能的數(shù)據(jù)[8]。

2 分子技術(shù)

2.1 16S rRNA 測(cè)序法 16S rRNA 基因在細(xì)菌進(jìn)化過程中高度保守，該基因具有9 個(gè)高度可變的區(qū)域(V1 ～ V9)，不同細(xì)菌種群之間具有序列多樣性，因此可通過該序列鑒定細(xì)菌的特定屬或種[11-12]。根據(jù)序列的相似程度，通過計(jì)算機(jī)分析后分為可操作的分類單位(operational taxonomic unit，OTU)，OTU 相似性為97%或以上通常被認(rèn)為屬于同一種屬水平[13]。

16S rRNA 測(cè)序法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較，不僅檢出率更高，而且可測(cè)出更多細(xì)菌物種數(shù)量。Dowd等[14]的研究顯示，傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)在55%的患者中顯示有革蘭陽(yáng)性細(xì)菌生長(zhǎng)，16S rRNA 測(cè)序則為75%；而嗜胨菌屬、厭氧球菌屬以及棒狀桿菌屬只在16S rRNA 測(cè)序中分析出來(lái)。同樣，Gardner等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)法極大地低估了微生物負(fù)荷和潛在病原體的存在。此外，Banerjee 等[16]將培養(yǎng)法及PCR 法鑒定結(jié)果為陰性的10 個(gè)樣本以16S rRNA 測(cè)序再次鑒定，結(jié)果顯示其中6 個(gè)樣本存在變形桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬。國(guó)內(nèi)胡萍等[17]基于16S rRNA 測(cè)序分析糖尿病足骨髓炎感染的病原微生物，與培養(yǎng)法相比，16S rRNA 測(cè)序除了陽(yáng)性檢出率較高、平均每個(gè)樣本病原菌數(shù)較多以外，革蘭陰性菌所占的比例也較高(67.16% vs 50.00%)，甚至檢測(cè)出不存在于培養(yǎng)法的菌屬13 種，其中11 種為專性厭氧菌或嚴(yán)格厭氧菌，證實(shí)16S rRNA 測(cè)序更為準(zhǔn)確全面，尤其對(duì)革蘭陰性菌和厭氧菌有顯著的優(yōu)勢(shì)。在鑒定罕見細(xì)菌時(shí)16S rRNA 測(cè)序分析也顯示獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。通過16S rRNA 測(cè)序方法在糖尿病足中檢測(cè)到了食酸戴爾福特菌、嗜線蟲沙雷菌、唾液鏈球菌、核粒梭桿菌、琥珀酸桿菌、佩滕科費(fèi)爾葡萄球菌等培養(yǎng)法較少培養(yǎng)出的菌種[18]。

不可忽略的是，16S rRNA 測(cè)序同樣存在一定的局限性。如基因的特定區(qū)域需要與相應(yīng)的引物結(jié)合以產(chǎn)生PCR 產(chǎn)物，因此引物的應(yīng)用不足也會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。此外，相關(guān)性較高的物種之間，高度可變區(qū)的多樣性會(huì)降低，需要設(shè)計(jì)多個(gè)引物組來(lái)擴(kuò)增不同高度可變區(qū)，以減少誤差。同時(shí)，由于此法是擴(kuò)增所有DNA，因此無(wú)法區(qū)分存活和死亡病原體；人線粒體DNA 的污染也會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果[13]。而且，16S rRNA 測(cè)序僅限于測(cè)病原體基因組的單個(gè)區(qū)域，缺乏對(duì)糖尿病足感染機(jī)制的認(rèn)識(shí)，如細(xì)菌的功能途徑、生物膜、毒力因子、抗菌藥敏感度等。

2.2 宏基因組測(cè)序法 宏基因組測(cè)序是利用非靶向測(cè)序來(lái)測(cè)定樣品中所有微生物的基因組，能夠彌補(bǔ)培養(yǎng)法和16S rRNA 測(cè)序法的不足[19-20]。這種新興的技術(shù)使微生物群落的潛在功能、種群之間的相互作用更加清晰，甚至對(duì)復(fù)雜傷口的遺傳潛力進(jìn)行全局表征[21]。隨著測(cè)序通量的增加和測(cè)序成本的下降，宏基因組測(cè)序在臨床上嶄露頭角。

Kalan 等[22]利用宏基因組測(cè)序法對(duì)100 例無(wú)感染癥狀的糖尿病足潰瘍患者標(biāo)本進(jìn)行分析，在菌株水平方面研究樣本的微生物群落，并鑒定微生物的毒力和致病性。這項(xiàng)研究顯示，糖尿病足患者中最豐富的細(xì)菌為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、紋帶棒桿菌和糞便產(chǎn)堿桿菌，此外還有疏螺旋體屬、產(chǎn)酸克雷伯菌、不解糖卟啉單胞菌等少見菌種。

為了分析糖尿病足感染微生物組的基因功能，研究者通常利用SEED 數(shù)據(jù)庫(kù)(種子數(shù)據(jù)庫(kù))預(yù)測(cè)微生物的作用途徑[23]。Kalan 等[22]的研究表明，較深且氧合不良的傷口與微生物高代謝密切相關(guān)，包括莢膜、細(xì)胞外多糖和糖酵解的產(chǎn)生等。創(chuàng)面的不愈合及嚴(yán)重程度與金黃色葡萄球菌菌株相關(guān)，且首次提出金黃色葡萄球菌7372 和金黃色葡萄球菌10757 菌株是糖尿病足潰瘍的優(yōu)勢(shì)菌株，基因組比對(duì)分析顯示，兩者以不同的噬菌體依賴性控制毒力相關(guān)的基因座。金黃色葡萄球菌7372 株還富含與免疫逃逸相關(guān)的不同毒力因子、擴(kuò)散感染的葡萄球菌激酶、抑制人類免疫調(diào)節(jié)作用和吞噬作用的scn 基因等致病因子。然而，葡萄球菌腸毒素C-2、腸毒素A 則為金黃色葡萄球菌10757 株所獨(dú)有。正是基于基因組檢測(cè)出致病菌的多樣化導(dǎo)致不同的宿主反應(yīng)和臨床結(jié)果。

宏基因組測(cè)序雖能提供樣本中微生物群落基因的“全景圖”，但無(wú)法區(qū)分基因是表達(dá)還是沉默，因此可能會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果。另外，宏基因組測(cè)序產(chǎn)生巨大而復(fù)雜的數(shù)據(jù)庫(kù)，可多達(dá)數(shù)百Gb 的數(shù)據(jù)序列，而回收的DNA 序列是片段性的，因此在宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)新的非編碼RNA(ncRNA)和核糖開關(guān)相比在單個(gè)基因組中更加困難[24]。

2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序法 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序法利用樣品中分離出的mRNA 挖掘群落中活性基因的多樣性及表達(dá)譜[25]。其能識(shí)別基因表達(dá)的生物特征，同時(shí)避免了微陣列的基因鑒定、交叉雜交、背景噪聲等缺點(diǎn)[26]。Leung 等[27]對(duì)感染肺炎克雷伯菌或銅綠假單胞菌的傷口進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，傷口周圍細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的下調(diào)以及浸潤(rùn)性白細(xì)胞特征轉(zhuǎn)錄物的上調(diào)可作為傷口愈合不良或傷口特異性治療的標(biāo)志物。Karna 等[28]發(fā)現(xiàn)傷口從感染到愈合的過程中，不同類別ncRNA 的調(diào)節(jié)遵循連續(xù)且協(xié)調(diào)的模式。該研究評(píng)估了傷口在對(duì)抗銅綠假單胞菌感染時(shí)的轉(zhuǎn)錄組變化，在傷口接種細(xì)菌后的2 h，傷口邊緣下調(diào)的基因包括幾乎所有的ncRNA( 包括snoRNA，miRNA) 和RNU6 假基因，這些下調(diào)先于皮膚富集編碼基因表達(dá)的下調(diào)。但隨著感染的加劇，在下調(diào)的基因中，ncRNA 的表達(dá)仍然過多。感染5 d 和9 d 后，對(duì)照組ncRNA 數(shù)量減少，而仍存在感染或愈合欠佳的傷口，ncRNA數(shù)量增加。

值得注意的是，蛋白組學(xué)在病原體鑒定方面也能識(shí)別基因表達(dá)的生物特征。雖未見使用蛋白組學(xué)對(duì)糖尿病足病原體鑒定以及其致病機(jī)制的研究，但Klein 和Rianey 等[29-30]利用蛋白組學(xué)解釋口腔疾病中變形鏈球菌的致病機(jī)制，表明蛋白組學(xué)在研究病原體致病方面具有一定的潛力。目前，關(guān)于糖尿病足感染方面尚無(wú)將宏基因組測(cè)序與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序或蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合使用的研究報(bào)道。但Lassek 等[31]將宏基因組測(cè)序與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合起來(lái)，很好地分析生物膜相關(guān)的尿路感染致病機(jī)制。通過宏基因組測(cè)序進(jìn)行群落分析，銅綠假單胞菌和摩根菌均被鑒定為主要微生物。蛋白質(zhì)組學(xué)分析隨后在功能水平上明確銅綠假單胞菌上調(diào)了參與紅細(xì)胞降解、鐵載體系統(tǒng)、生物膜、抗生素耐藥和致病性等的蛋白質(zhì)水平。另外，蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)的質(zhì)量與宏基因組學(xué)分析的質(zhì)量密不可分。蛋白組學(xué)需要根據(jù)宏基因組學(xué)來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。可見，宏基因組發(fā)揮優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，若結(jié)合其他分子技術(shù)(如轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué))研究糖尿病足感染，可能會(huì)達(dá)到事半功倍的效果。

3 基于分子技術(shù)對(duì)糖尿病足感染進(jìn)行精準(zhǔn)治療

目前糖尿病足的抗菌治療主要依賴藥敏試驗(yàn)，一般采用細(xì)菌培養(yǎng)或基于PCR 的方法，但這兩者僅限于常見的細(xì)菌和抗生素，且采樣和運(yùn)送過程也會(huì)極大地影響結(jié)果[18]。使用宏基因組學(xué)鑒定糖尿病足的病原體耐藥基因可以克服以上局限性，并提供有關(guān)耐藥的所有基因信息[32]。Kalan 等[22]進(jìn)行的宏基因組測(cè)序研究表明，超過50%的樣本含有氨基糖苷、大環(huán)內(nèi)酯、β-內(nèi)酰胺、四環(huán)素類的耐藥基因，其中金黃色葡萄球菌10757 菌株含有大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素和氨基糖苷類耐藥基因，這可能解釋糖尿病足潰瘍中多耐藥病原體的增加。宏基因組測(cè)序僅表明存在編碼耐藥的基因，而轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以幫助我們了解耐藥基因的表達(dá)與否。Hall 等[33]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，鑒定了PA3225調(diào)控的基因產(chǎn)物(如ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PA3228)，發(fā)現(xiàn)其可能與銅綠假單胞菌抗生素耐藥性有關(guān)。更重要的是這些分子技術(shù)可以幫助我們對(duì)新耐藥細(xì)菌在臨床出現(xiàn)之前進(jìn)行預(yù)測(cè)。

歐洲傷口管理協(xié)會(huì)已禁止對(duì)未感染的傷口使用抗生素[34]。但臨床工作中，以防發(fā)生感染或促進(jìn)傷口愈合，臨床醫(yī)生經(jīng)常對(duì)未感染的糖尿病足潰瘍患者也使用不同種類的抗生素。這無(wú)疑加劇了耐藥菌株甚至多耐藥的“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)。Messad 等[35]通過基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn)，含有ROSA 樣噬菌體的金黃色葡萄球菌菌株并無(wú)毒性，這可能解釋了該細(xì)菌在慢性糖尿病足傷口中的定殖能力以及它們與宿主的共生關(guān)系。該研究建議我們盡可能利用有效的方法檢測(cè)慢性傷口中是否存在增加或降低細(xì)菌毒力的噬菌體，以明確使用抗生素的必要性。

4 結(jié)語(yǔ)

分子技術(shù)讓我們對(duì)糖尿病足感染的微生態(tài)也有了更廣闊的認(rèn)識(shí)，尤其是罕見的、培養(yǎng)條件苛刻的病原體。然而，目前國(guó)內(nèi)分子技術(shù)在糖尿病足感染中的應(yīng)用較少，有以下幾個(gè)客觀原因：1)相比傳統(tǒng)培養(yǎng)法花費(fèi)高；2)測(cè)序技術(shù)要求高；3)對(duì)測(cè)序結(jié)果的解讀需要較強(qiáng)的專業(yè)知識(shí)；4)目前數(shù)據(jù)庫(kù)仍需進(jìn)一步完善。另外也存在一定的主觀因素：我們對(duì)分子技術(shù)的認(rèn)識(shí)不夠深入，僅將分子技術(shù)作為一種科研工具。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)和測(cè)序成本的下降，臨床醫(yī)生認(rèn)識(shí)微生物的方法不能局限于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，應(yīng)合理利用分子技術(shù)進(jìn)行更多、更完善的系統(tǒng)性臨床研究，為梳理糖尿病足宿主與病原體錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系、發(fā)現(xiàn)更有效的抗感染方法等提供更全面可靠的依據(jù)。