關(guān)福晶，殷振杰，萬長(zhǎng)長(zhǎng)，馬亞杰，于 泓

(哈爾濱師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025)

防腐劑作為一種食品添加劑,可有效減緩微生物繁殖引起的食品變質(zhì)，使其保持原有品質(zhì)。苯甲酸、山梨酸為食品添加劑中的一類防腐劑，在食品、飲品中被廣泛使用[1-3]，其用法及用量直接決定食品的品質(zhì)。食品安全問題與人們的切身利益和健康密切相關(guān)。若食品添加劑的含量控制不當(dāng)，長(zhǎng)期過量食用苯甲酸鈉會(huì)引起肝腎功能損傷、致癌、苯中毒的危害，對(duì)人體健康造成嚴(yán)重威脅[4-5]。由于人們對(duì)食品中苯甲酸、山梨酸的含量倍受關(guān)注，因此有必要發(fā)展檢測(cè)苯甲酸和山梨酸的簡(jiǎn)單、快捷、精準(zhǔn)的分析方法。

目前文獻(xiàn)報(bào)道分析山梨酸和苯甲酸的常見方法有紫外分光光度法[6-7]、氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8-9]、高效液相色譜或高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-12]、毛細(xì)管電泳法[13-14]等。這些方法仍在不斷發(fā)展中。離子液體作為一種新型的綠色溶劑近年在化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[15-17]。在色譜分析領(lǐng)域，離子液體可以用作氣相色譜與液相色譜的固定相[18-19]，以及液相色譜流動(dòng)相的添加劑等[20]。由于離子液體作為液相色譜流動(dòng)相添加劑可有效改善分析物的保留、分離和檢測(cè)，并且實(shí)驗(yàn)上易于實(shí)現(xiàn)，因而引起色譜研究者的關(guān)注，相關(guān)研究報(bào)道不斷增多。目前，采用離子液體作為液相色譜流動(dòng)相添加劑分析堿性有機(jī)化合物[21-22]、陰離子[23-24]、陽離子[25-26]等已有報(bào)道，但尚未見檢測(cè)苯甲酸和山梨酸的研究報(bào)道。

本研究探索采用咪唑離子液體作為流動(dòng)相添加劑，反相色譜法分析苯甲酸和山梨酸的可能性。其目的是發(fā)展分離和檢測(cè)苯甲酸和山梨酸的新方法?？疾炝诉溥螂x子液體種類與濃度、甲醇濃度、紫外檢測(cè)波長(zhǎng)等因素對(duì)反相色譜法分離和檢測(cè)苯甲酸和山梨酸的影響規(guī)律，并優(yōu)化了色譜條件。建立了以咪唑離子液體為流動(dòng)相添加劑的反相色譜-紫外檢測(cè)苯甲酸和山梨酸的方法，并成功將方法應(yīng)用于食品飲料的分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

苯甲酸(C6H5COOH，分析純)、山梨酸(C6H8O2，分析純)、甲醇(色譜純)，均購自北京百靈威科技有限公司；氯化1-乙基-3-甲基咪唑([EMIm][Cl])、氯化1-丁基-3-甲基咪唑([BMIm][Cl])、氯化1-己基-3-甲基咪唑([HMIm][Cl])離子液體，純度均不小于99%，購自上海成捷化學(xué)有限公司。

1200 型高效液相色譜儀(美國(guó) Agilent 公司)，配有G1322A 型在線脫氣機(jī)、G1311A 型四元泵、ALSG1329 型自動(dòng)進(jìn)樣器、TCCG1316A 型色譜柱溫箱、DADG1315D型二極管陣列檢測(cè)器和 Revision B.04.01 色譜工作站；DOA-P504-BN 型無油真空泵(美國(guó)IDEX公司)；Simplicity 型純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore 公司)。

1.2 溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別取苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，用超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)分別溶解后置于各自容量瓶中定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度均為0.30 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存于冰箱冷藏室中。待用時(shí)，取5 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至50 mL容量瓶中，稀釋成質(zhì)量濃度為30.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 流動(dòng)相的配制和處理依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，用超純水配制一定濃度的甲醇-離子液體流動(dòng)相,經(jīng)0.22 μm濾膜抽濾和真空脫氣后備用。

1.3 色譜條件

采用Agilent公司ZORBAX ODS色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)進(jìn)行分離；流動(dòng)相為甲醇-0.2 mmol/L[BMIm][Cl]水溶液(40>∶60,體積比)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；流速1.0 mL/min；色譜柱溫度35 ℃；進(jìn)樣體積20 μL。

1.4 樣品處理與檢測(cè)

將碳酸飲料、橙味飲料以及發(fā)酵飲料分別稀釋10倍，即用移液管精密量取原樣品10.0 mL至100 mL容量瓶中加水定容，搖勻。取樣品4份，其中1份作為本底，另外3份分別加入5.0、20.0、40.0 mg/L的苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率考察。稀釋樣品溶液經(jīng)0.22 μm微孔過濾膜過濾后，按照“1.3”色譜條件進(jìn)行分析。

圖1 咪唑離子液體種類對(duì)苯甲酸和山梨酸分離效果的影響Fig.1 Effect of imidazolium ionic liquid type on separation efficiencies of benzoic acid and sorbic acidA:[EMIm][Cl];B:[BMIm][Cl];C:[HMIm][Cl];D:H2O.1:benzoic acid;2:sorbic acid;chromatographic conditions：column:ZORBAX ODS;mobile phases:methanol-0.2 mmol/L ionic liquid aqueous solution(40>∶60);ultraviolet detection:230 nm;column temperature:30 ℃;flow rate:1.0 mL/min;injection volume:20 μL

2 結(jié)果與討論

2.1 咪唑離子液體種類與濃度的影響

用甲醇-咪唑離子液體水溶液為流動(dòng)相，分別考察了不同咪唑離子液體種類([HMIm][Cl]、[BMIm][Cl]、[EMIm][Cl])作為流動(dòng)相添加劑時(shí)，對(duì)苯甲酸和山梨酸分離和檢測(cè)的影響(見圖1)。由圖1可知，當(dāng)流動(dòng)相只用甲醇-水時(shí)，2種分析物的保留時(shí)間較長(zhǎng)，色譜峰的對(duì)稱性較差。當(dāng)流動(dòng)相中加入離子液體后，分析物的保留時(shí)間縮短，色譜峰的對(duì)稱性變好，檢出限降低，并按[HMIm][Cl]、[BMIm][Cl]、[EMIm][Cl]次序，分析物的保留時(shí)間縮短程度增大。實(shí)驗(yàn)也考察了甲酸銨作為流動(dòng)相添加劑對(duì)2種分析物測(cè)定的影響。結(jié)果表明，相比于咪唑離子液體，甲酸銨作為流動(dòng)相添加劑時(shí)，2種分析物的分離度較小，檢出限較高。綜合考慮保留時(shí)間、分離度和檢出限等，選擇[BMIm][Cl]作為最佳流動(dòng)相添加劑。

圖2 [BMIm][Cl]濃度對(duì)苯甲酸和山梨酸分離效果的影響Fig.2 Effect of [BMIm][Cl]concentration on separation efficiencies of benzoic acid and sorbic acid [BMIm][Cl]concentration(A-E):0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mmol/L;1:benzoic acid;2:sorbic acid

圖3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苯甲酸和山梨酸分離效果的影響Fig.3 Effect of methanol volume proportion on separation efficiencies of benzoic acid and sorbic acidvolume proportion of methanol(A-H):15%，20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%；1:benzoic acid;2:sorbic acid

圖5 發(fā)酵飲料樣品中苯甲酸和山梨酸的色譜圖Fig.5 Chromatograms of benzoic acid and sorbic acid in fermented beverage samplesA:fermented beverage;B:standard addition 5.0 mg/L;C:standard addition 20.0 mg/L;D:standard addition 40.0 mg/L;1:benzoic acid;2:sorbic acid

以甲醇-[BMIm][Cl]水溶液為流動(dòng)相，進(jìn)一步考察不同離子液體[BMIm][Cl]濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L)對(duì)苯甲酸和山梨酸分離的影響(見圖2)。由圖2可知，隨著[BMIm][Cl]濃度的升高，2種分析物的保留時(shí)間逐漸縮短，分離度逐漸減小。保留時(shí)間逐漸縮短的原因是[BMIm][Cl]起到了洗脫劑的作用，其濃度的增加導(dǎo)致流動(dòng)相的洗脫能力增強(qiáng)[27]。綜合考慮保留時(shí)間、分離度，選用[BMIm][Cl]的最佳濃度為0.2 mmol/L。

2.2 甲醇濃度的影響

以甲醇-0.2 mmol/L[BMIm][Cl]為流動(dòng)相，保持其他色譜條件不變，考察了流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)變化(15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%)對(duì)分離檢測(cè)的影響(見圖3)。結(jié)果顯示，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大，苯甲酸和山梨酸的保留時(shí)間縮短。這是由于甲醇濃度的增大,使得流動(dòng)相的疏水性逐漸增強(qiáng)，導(dǎo)致分析物苯甲酸和山梨酸在反相固定相上的保留減弱，保留時(shí)間縮短[28]。當(dāng)流動(dòng)相中甲醇濃度較低時(shí)，兩種分析物的保留時(shí)間較長(zhǎng)；而當(dāng)甲醇濃度較高時(shí)，兩種分析物的保留時(shí)間過短。綜合考慮分析物的保留時(shí)間和分離度，選擇流動(dòng)相中甲醇的體積分?jǐn)?shù)為40%。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的影響

苯甲酸紫外吸收光譜的最大吸收波長(zhǎng)在228 nm 左右，山梨酸的最大吸收波長(zhǎng)在252 nm 左右[29]。本實(shí)驗(yàn)考察了檢測(cè)波長(zhǎng)在200～290 nm變化時(shí)對(duì)測(cè)定苯甲酸和山梨酸的影響。結(jié)果顯示，檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)2種分析物的峰高影響較大。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm時(shí)，2種物質(zhì)的峰高、噪音值均較好。因此，實(shí)驗(yàn)選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。

2.4 色譜柱溫度的影響

當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-0.2 mmol/L[BMIm][Cl](40>∶60)，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，流速為1.0 mL/min時(shí)，考察了不同色譜柱溫度(25、30、35 ℃)對(duì)分析物測(cè)定的影響。結(jié)果顯示，隨著色譜柱溫度的升高，2種分析物的保留時(shí)間逐漸縮短，分離度逐漸增大(2.12、2.29、2.62)，噪聲值略有增大。綜合考慮保留時(shí)間、分離度和基線噪聲，選擇色譜柱溫度為35 ℃。

2.5 線性范圍與檢出限

通過以上考察，確定分析苯甲酸和山梨酸的適宜色譜條件見“1.3”。在此色譜條件下測(cè)定2種分析物的標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、50.0、80.0、100.0 mg/L)，其中30.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖4。在7.0 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)苯甲酸和山梨酸的分離和檢測(cè)。以峰面積(y)對(duì)分析物的質(zhì)量濃度(x，mg /L)計(jì)算線性回歸方程。以 3 倍信噪比(S/N=3)計(jì)算檢出限。連續(xù)7次重復(fù)測(cè)定苯甲酸(30.0 mg /L)和山梨酸(30.0 mg /L)混合標(biāo)樣，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDt)。結(jié)果顯示，苯甲酸和山梨酸均在1.0～100.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.999 9和0.999 7，檢出限均為0.02 mg/L，RSDs和RSDt均小于1.5%。方法符合定量分析的要求。

2.6 實(shí)際樣品的分析

將本方法應(yīng)用于碳酸飲料、橙味飲料和發(fā)酵飲料中苯甲酸和山梨酸的分析。按“1.4”進(jìn)行樣品處理和分析，色譜圖見圖5。由圖5可知樣品基質(zhì)對(duì)苯甲酸和山梨酸的測(cè)定基本無影響。樣品分析結(jié)果和加標(biāo)回收率見表1。2種物質(zhì)的加標(biāo)回收率為93.9%～104%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于4.0%，表明方法的準(zhǔn)確性和精密度良好，能滿足待測(cè)物定量分析的要求。

表1 飲料中苯甲酸和山梨酸的含量及其加標(biāo)回收率(n=5)Table 1 Contents of benzoic acid and sorbic acid in drink samples and their spiked recoveries(n=5)

3 結(jié) 論

本研究發(fā)展了以咪唑離子液體作為流動(dòng)相添加劑的反相色譜測(cè)定苯甲酸和山梨酸的方法，采用反相色譜柱，以甲醇-[BMIm][Cl]水溶液為流動(dòng)相，可以實(shí)現(xiàn)2種物質(zhì)的分離和紫外檢測(cè)，并成功應(yīng)用于飲料樣品的測(cè)定。本方法的檢出限較低，線性、重現(xiàn)性及準(zhǔn)確性滿足定量分析的要求，且方法簡(jiǎn)便，易于推廣使用，可為食品中的苯甲酸和山梨酸檢測(cè)提供參考。