崔麗麗，樸向民，馮志偉，于 營，閆梅霞，鄭培和*，姚麗娜

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112;2.撫松縣參王植保有限責(zé)任公司，吉林 長白山 134504;3.吉林省中藥材種植(養(yǎng)殖)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長春 130112)

黃芪是豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根，味甘，性微溫，主要成分為皂苷、多糖和黃酮類，具有保肝利尿，補(bǔ)氣固表，健脾補(bǔ)中，抗衰老、抗疲勞，對心腦血管、保護(hù)肝臟、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等功效[1]，為臨床常用藥物。建國前，黃芪主要滿足中醫(yī)臨床調(diào)劑用，隨著中成藥工業(yè)的快速發(fā)展，黃芪成為了中成藥和保健品原料，國內(nèi)外市場對其需求日趨增大，我國成為黃芪的主要產(chǎn)地及出口國。然而，近年來中藥材農(nóng)殘問題已引起國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[2]，韓國、日本等對中藥材中農(nóng)藥殘留限量的相關(guān)規(guī)定作了很大調(diào)整，不僅增加了農(nóng)藥檢測種類，還降低了某些常用農(nóng)藥殘留限量值；日本肯定列表對未制定限量標(biāo)準(zhǔn)的農(nóng)藥均采取一律標(biāo)準(zhǔn)0.01 mg/kg[3]，這對我國的中藥材種植中農(nóng)藥的合理使用及農(nóng)殘檢測技術(shù)提出了新的挑戰(zhàn)。目前，我國2015版《中國藥典》規(guī)定了黃芪中總六六六(α-BHC、β-BHC、δ-BHC、γ-BHC之和)和總滴滴涕(p,p′-DDE、p,p′-DDD、o,p′-DDT、p,p′-DDT之和)均不得超過0.2 mg/kg，五氯硝基苯不得超過0.1 mg/kg[4]。此外，黃芪病害有白粉病、麻口病、銹病、立枯病、紫紋羽病和根腐病等[5-7]，化學(xué)防治常施用多菌靈、甲霜靈、嘧菌酯、咯菌腈等農(nóng)藥[8]。因此，為了打破出口貿(mào)易壁壘，亟待建立黃芪中更多品種農(nóng)藥殘留的快速檢測方法。

目前，農(nóng)藥殘留檢測的提取方法有超聲法、振蕩法、均質(zhì)法、固相萃取、索氏提取及超臨界流體萃取等[9-11]，凈化方法有濃硫酸磺化法、液液萃取(LLE)、固相萃取凈化(SPE)、凝膠滲透色譜凈化(GPC)及QuEChERS方法等[12-15]，分析技術(shù)為氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)及其串聯(lián)質(zhì)譜法等[16-20]。其中QuEChERS法(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe)是基于分散固相萃取發(fā)展起來的集萃取和凈化為一體的新型前處理方法，已成為美國分析化學(xué)家協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)方法(AOAC 2007.01)[21]和歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會標(biāo)準(zhǔn)方法(EN 15662)[22]，與SPE和LLE等方法相比能夠有效縮短前處理時(shí)間，提高檢測效率，顯著降低了有機(jī)溶劑用量，已被廣泛用于食品、蔬菜等的農(nóng)殘檢測[23-27]，以及食品中藥物[28-29]、真菌毒素[30]的檢測。多壁碳納米管是由多層石墨片卷曲而成的碳納米管，層與層之間呈無序排列，具有比表面積大、傳導(dǎo)率高、化學(xué)穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)，已在農(nóng)藥殘留分析中應(yīng)用較多，且備受重視[31-32]。本研究根據(jù)黃芪病害防治及農(nóng)藥使用等實(shí)際情況，將多壁碳納米管與QuEChERS方法相結(jié)合，建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定黃芪中α-六六六、β+γ-六六六、δ-六六六、五氯硝基苯、p,p′-滴滴伊、o,p′-滴滴涕、p,p′-滴滴滴、p,p′-滴滴涕、甲霜靈、二嗪磷、七氯、嘧菌環(huán)胺、腐霉利、順式氯丹、反式氯丹、咯菌腈16種農(nóng)藥殘留的分析方法，并成功用于實(shí)際黃芪樣品中16種農(nóng)藥殘留的檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫科技有限公司),ML503、ME204天平(感量分別為0.000 1 g和0.000 01 g,梅特勒公司),TGL-16M型高速離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)有限公司),IKA T25均質(zhì)器(德國IKA公司),LSE6776渦旋混合器(康寧公司)。

乙腈、丙酮、正己烷(色譜純,美國Fisher公司)；0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜(北京迪馬科技有限公司)；氯化鈉、氯化鋰、無水硫酸鈉(分析純,北京化學(xué)廠)；多壁碳納米管(MWNTs)A、B、C內(nèi)徑均為5～10 nm,長度為10～30 μm,外徑從小到大分別為10～20、20～30、30～50 nm(上海麥克林生化有限公司)；N-丙基乙二胺(PSA)和MgSO4(分析純,北京迪科馬科技有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、p,p′-滴滴滴、o,p′-滴滴涕、p,p′-滴滴涕、p,p′-滴滴伊、嘧菌環(huán)胺、腐霉利、五氯硝基苯、七氯、二嗪磷、順氏氯丹、反式氯丹、甲霜靈和咯菌腈農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度均大于99.5%,購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。黃芪于2018年9月采集于內(nèi)蒙古地區(qū),經(jīng)專家鑒定為膜莢黃芪AstragalusMembranaceus(Fisch.) Bunge。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取50 mg(精確至0.01 mg)各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用乙腈溶解并定容配成質(zhì)量濃度均為500 μg/mL的單標(biāo)儲備液,于-20 ℃冷凍儲存。精密吸取適量各農(nóng)藥單標(biāo)儲備液于25 mL容量瓶中用乙腈定容,使用時(shí)逐級稀釋成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

鮮黃芪經(jīng)40 ℃后干燥后取不少于200 g試樣,置于高速粉碎機(jī)中粉碎,過100目篩3～5次后充分混勻,裝入聚乙烯塑料袋中保存。

精確稱取已粉碎均勻試樣1.0 g(精確至1 mg),加入10 mL水浸泡30 min,再加入20 mL乙腈,高速(3 000 r/min)渦旋振蕩提取3 min,加入1.5 g NaCl+6 g MgSO4混勻1 min,以5 000 r/min離心5 min,取上清液5 mL,加入到由75 mg PSA、450 mg MgSO4與20 mg多壁碳納米管A組成的混合凈化劑中,渦旋1 min,混勻,以5 000 r/min離心5 min,取上清液上機(jī)檢測。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為HP-5ms石英毛細(xì)管柱,30 m×0.25 mm(內(nèi)徑)×0.25 μm(膜厚)；程序升溫：初始柱溫100 ℃,保持1 min,以30 ℃/min升至130 ℃，再以5 ℃/min升至250 ℃，保持10 min,最后以10 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃,載氣為高純氦氣(純度>99.999%),流速1.0 mL/min；尾吹氣流量29 mL/min,進(jìn)樣體積為1 μL,進(jìn)樣方式為脈沖不分流進(jìn)樣,脈沖壓力172 250 Pa,延時(shí)0.75 min,0.75 min后開閥。

質(zhì)譜條件：離子源為電子轟擊源(EI),電離能量70 eV,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,溶劑延遲時(shí)間10 min,選擇離子監(jiān)測(SIM)模式,傳輸線溫度280 ℃。16種農(nóng)藥的保留時(shí)間及檢測離子見表1。

表1 16種農(nóng)藥的質(zhì)量分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for 16 pesticides

圖1 優(yōu)化色譜條件下的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of pesticides standard solution under optimization chromatographic conditionsthe number 1-20 were the same as those in Table 1

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

選擇對弱極性化合物分離較好的毛細(xì)管柱色譜柱HP-5ms,通過SCAN模式掃描,選擇掃描質(zhì)量范圍為30～500 amu,確定每種農(nóng)藥的保留時(shí)間及定性定量離子,并建立SIM離子監(jiān)測方法。每種農(nóng)藥選擇一個(gè)定量離子,2個(gè)定性離子,按照保留時(shí)間順序分段檢測,因β-六六六和γ-六六六兩個(gè)譜峰重疊,故合并計(jì)算為一種農(nóng)藥，優(yōu)化條件后16種的農(nóng)藥保留時(shí)間、定量離子、定性離子見表1,總離子流圖見圖1。

2.2 萃取劑與萃取鹽的選擇

2.3 多壁碳納米管的選擇

向空白樣品中加入一定量農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配成0.5 mg/kg的樣品溶液，以16種農(nóng)藥的回收率考察“1.1”中A、B、C 3種型號MWCNTs的凈化效果。結(jié)果顯示，A、B、C 3種MWCNTs凈化后回收率在70%～120%范圍內(nèi)的農(nóng)藥數(shù)量分別為13、10、7種，這是因?yàn)镸WCNTs的外徑越小，其比表面積越大，吸附能力越強(qiáng)，因此選擇MWCNTs A進(jìn)行凈化。此外，實(shí)驗(yàn)還考察了MWCNTs A的用量(5、10、20、25、30、35、40 mg)對凈化效果的影響，發(fā)現(xiàn)其用量為20 mg時(shí)，回收率在70%～120%范圍內(nèi)的農(nóng)藥數(shù)量最多(13種)，因此最終選擇20 mg MWCNTs A進(jìn)行凈化。

2.4 凈化劑種類及用量的優(yōu)化

根據(jù)本研究所涉及的農(nóng)藥種類和特性，選擇N-丙基乙二胺(PSA)+無水MgSO4+ MWCNTs進(jìn)行組合凈化[34]，實(shí)驗(yàn)考察了50 mg PSA+300 mg MgSO4+20 mg MWCNTs A、75 mg PSA+450 mg MgSO4+20 mg MWCNTs A和150 mg PSA+900 mg MgSO4+20 mg MWCNTs A的凈化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，75 mg PSA+450 mg MgSO4+20 mg MWCNTs A的凈化效果最好，此時(shí)農(nóng)藥的回收率在70%～120%范圍內(nèi)的數(shù)量最多。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(ME=B/A，A為純?nèi)軇┲修r(nóng)藥的響應(yīng)值，B為樣品基質(zhì)中添加的相同含量農(nóng)藥響應(yīng)值)大于1.2為基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)，小于0.9為基質(zhì)效應(yīng)減弱。本研究中大多數(shù)農(nóng)藥均有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，因此選擇脈沖不分流進(jìn)樣方式并結(jié)合基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)法來消除基質(zhì)效應(yīng)的影響[30]。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，提取液體積過大時(shí)，大多數(shù)農(nóng)藥的ME較大，但提取液體積過小時(shí)，農(nóng)藥提取不完全，回收率較低。綜合考慮，選擇提取液體積為5.0 mL，此時(shí)所有農(nóng)藥的ME和回收率均在合理范圍內(nèi)。

2.6 方法學(xué)考察

分別配制質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L的16種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，在優(yōu)化條件下測定。以各農(nóng)藥的定量離子峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對應(yīng)以質(zhì)量濃度(x,mg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別以3倍信噪比(S/N=3)和S/N=10計(jì)算檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。另向空白黃芪樣品中準(zhǔn)確加入一定量16種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.05、0.2、0.5 mg/kg，每個(gè)添加水平設(shè)定3個(gè)平行和1個(gè)空白對照，采用本方法測定并計(jì)算各農(nóng)藥的加標(biāo)平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=3)。結(jié)果顯示，α-六六六、β+γ-六六六、δ-六六六、五氯硝基苯、p,p′-滴滴伊、o,p′-滴滴涕、p,p′-滴滴滴、p,p′-滴滴涕、甲霜靈、二嗪磷、七氯、嘧菌環(huán)胺、腐霉利、順式氯丹、反式氯丹、咯菌腈16種農(nóng)藥在0.01～5.0 mg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.974～1.000，LOD為0.001～0.011 mg/kg，LOQ為0.002～0.035 mg/kg，3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為72.1%～115%，RSD為1.2%～14%。

表2 黃芪中16種農(nóng)藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限及定量下限Table 2 Linear ranges,correlation coefficients,recoveries,RSDs,LODs and LOQs for 16 pesticides in Astragalus membranaceus

圖2 實(shí)際樣品的色譜圖Fig.2 Chromatogram of a actual sample1：α-BHC;2：β+γ-BHC

2.7 實(shí)際樣品檢測

采集內(nèi)蒙古黃芪種植區(qū)內(nèi)12份生長期鮮黃芪,將其烘干粉碎后在優(yōu)化條件下測定。結(jié)果檢出α-六六六、β+γ-六六六,平均含量分別為0.011、0.013 mg/kg,其余農(nóng)藥未檢出,其中一份黃芪的色譜圖見圖2。

3 結(jié) 論

本研究采用改進(jìn)的QuChERS方法結(jié)合多壁碳納米管凈化,建立了中藥材黃芪中六六六、滴滴涕、五氯硝基苯等16種農(nóng)藥的GC-MS分析方法。該方法的平均回收率為71.9%～115%,RSD為1.2%～14%,完全符合農(nóng)藥殘留分析的要求,具有快速、準(zhǔn)確、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn),極大地提高了檢測效率,也減少了對環(huán)境的污染,保障了檢驗(yàn)人員的健康。