向 娟 王邦瓊 王 怡 徐 偉

(重慶三峽中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶市 404100，電子郵箱：haifanuu33@163.com)

Graves病又稱毒性彌漫性甲狀腺腫，是由促甲狀腺激素受體(thyroid-stimulating hormone receptor,TSHR)的抗體激活甲狀腺而導(dǎo)致甲狀腺功能亢進(jìn)的一種自身免疫性疾病。我國約有超過1 500萬例的甲亢患者，而Graves病患者數(shù)量約占全部甲亢病例的85%[1]。Graves病每年發(fā)病率為2/10萬至3/10萬，約有3%的30～60歲女性及0.5%的男性患此病[2]。Graves病患者會(huì)出現(xiàn)體重減輕、眼球突出、四肢肢端粗厚肥大、局部黏液性水腫、怕熱出汗、心悸、心動(dòng)過速、失眠、對(duì)周圍事物敏感、焦慮等癥狀，如果長期沒有得到合適有效的治療，會(huì)引起消瘦和甲亢性心臟病[3]。

近年來，應(yīng)用含TSHR-A亞單位的腺病毒免疫建立Graves病動(dòng)物模型被廣泛應(yīng)用于Graves病的研究，以探討其發(fā)病機(jī)制和有效的防治措施。夏枯草多糖具有良好的免疫增強(qiáng)活性[4]，故本研究通過觀察夏枯草多糖對(duì)小鼠Graves模型的影響，并探討其通過調(diào)控Ras/Raf/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)信號(hào)通路影響小鼠Graves病的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體級(jí)別BALB/c雌性小鼠160只，購于重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所[許可證號(hào)：SCXK(渝)2020-0006]，6～8周齡，體重18～20 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由攝食飲水，明暗周期為12 h/12 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與藥品 TSHR抗體(TSHR antibody,TRAb)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：TRE/96/2A) 購自天津阿斯?fàn)柹锟萍加邢薰荆凰牡饧谞钕僭彼?tetraiodothyronine，T4)試劑盒(貨號(hào)：XYTL-D-162；CAS號(hào)：51-48-9)購自上海熹垣生物科技有限公司；三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine,T3;批號(hào)：032519191001)、干擾素-γ(批號(hào)：032519193029)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6(批號(hào)：032519193004)、IL-17(批號(hào)：032519193024) 和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1;批號(hào)：032519193001)檢測(cè)試劑盒均購自上海晶抗生物科技有限公司；二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(批號(hào)：120915132)購自碧云天生物有限公司；二抗(批號(hào)：140740)以及Raf一抗(批號(hào)：297412-1)、磷酸化Raf(phosphorylated-Raf,p-Raf)一抗(批號(hào)297412-4)、絲裂原活化蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)1/2一抗(批號(hào)：AA1217B8088ZJ2)、磷酸化MEK(phosphorylated-MEK,p-MEK)1/2一抗(批號(hào)：263178)、ERK1/2一抗(批號(hào)：286514)、磷酸化ERK(phosphorylated-ERK,p-ERK)1/2一抗(批號(hào)：284174)均購自達(dá)瑞抗體技術(shù)有限公司。夏枯草多糖(廠家：貴陽新天藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：z19990052，批號(hào)：20190618)；甲巰咪唑片(廠家：Merck KGaA公司，國藥準(zhǔn)字：J20171078，批號(hào)：112635)。

1.3 Graves小鼠模型的建立 參照文獻(xiàn)[5]，通過注射Ad-TSHR289腺病毒(購自廣州云舟生物科技有限公司)建立Graves小鼠模型，具體操作步驟如下：選取150只小鼠，分別于第1天、第28天于小鼠脛前肌注射含2×109Pfu 優(yōu)化Ad-TSHR289腺病毒的磷酸緩沖鹽溶液1 mL；第49天后抽取各小鼠尾靜脈血檢測(cè)血清T4和TRAb水平，以小鼠血清T4、TRAb水平分別達(dá)到100 ng/mL、3 U/mL以上作為造模成功判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 動(dòng)物分組及干預(yù) 選取小鼠血清T4含量≥100 ng/mL且TRAb含量≥3 U/mL的模型小鼠30只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、夏枯草多糖組、甲巰咪唑組，每組10只。另取10只正常小鼠作為正常對(duì)照組。夏枯草多糖組給予夏枯草多糖(200 mg/kg)灌胃，0.4 mL/次，甲巰咪唑組給予甲巰咪唑(生理鹽水溶解，50 mg/kg)灌胃，0.4 mL/次，正常對(duì)照組和模型組每日予同體積生理鹽水灌胃，均1次/d，藥物干預(yù)5周后測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 一般情況：觀察4組小鼠的一般狀態(tài)、活動(dòng)、行為及毛色。

1.5.2 血清T4、T3及TRAb水平：小鼠末次給藥后，禁食不禁水1 d，摘眼球取血3 mL置于4 ℃冰箱保存過夜，36℃下4 000 r/min離心10 min，靜置后分離出血清。按照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用放射免疫分析法測(cè)定小鼠血清T4、T3水平，采用放射受體分析法測(cè)定TRAb水平。

1.5.3 血清干擾素γ、IL-6、IL-17和TGF-β1水平：將試劑盒平衡至室溫(20℃～25℃)，取上述血清，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)各組小鼠血清干擾素γ、IL-6、IL-1和TGF-β1表達(dá)水平。

1.5.4甲狀腺組織形態(tài)學(xué)觀察：摘眼球取血后，立即用頸椎脫臼法處死小鼠，摘取小鼠甲狀腺組織，置于10%福爾馬林中固定，常規(guī)切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，在顯微鏡下進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.5.5 甲狀腺組織相關(guān)蛋白表達(dá)水平：取1 g小鼠甲狀腺組織于研磨器中，于液氮下進(jìn)行研磨搗碎，依次加入RIPA和PMSF裂解液裂解組織，提取總蛋白，使用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒對(duì)提取的總蛋白進(jìn)行定量，按比例加入4×蛋白上樣緩沖液，95℃變性5 min，置于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲剖榛蛩徕c聚丙烯酰胺凝膠，上樣蛋白樣品后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，設(shè)置濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為100 V，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用TBST 緩沖液洗膜3次，5 min/次，加入由2% BSA TBS配制的封閉液中，于室溫?fù)u床上孵育2 h進(jìn)行封閉。 完成后使用PBS洗膜2次，5 min/次，然后加入Raf、MEK1/2、ERK1/2及p-Raf、p-MEK、p-ERK一抗工作液5℃條件下孵育過夜(1 ∶2 000稀釋)，孵育完成使用PBS洗膜3次，5min/次，室溫條件下孵育二抗2 h(1 ∶10 000稀釋)，再次使用PBS洗膜3次(5 min/次)將新鮮配制的電化學(xué)發(fā)光液滴加到聚偏二氟乙烯膜表面，轉(zhuǎn)移至成像分析系統(tǒng)(購自濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司)暗箱中曝光，采集圖像并分析。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參，以相對(duì)光密度值代表蛋白相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠的一般情況 正常對(duì)照組小鼠未見活動(dòng)、行為及毛色的異常。Graves模型小鼠易動(dòng)、煩躁和出現(xiàn)互相攻擊的情況并有一定的脫毛現(xiàn)象發(fā)生，糞便較多且墊料較為潮濕。給藥處理5周后，夏枯草多糖組和甲巰咪唑組小鼠互相攻擊、煩躁、易動(dòng)和脫毛的現(xiàn)象均有不同程度減輕，糞便減少，其中夏枯草多糖組效果最為明顯。

2.2 4組小鼠血清T4、T3及TRAb的水平比較 模型組、夏枯草多糖組、甲巰咪唑組血清T4、T3及TRAb水平均高于正常對(duì)照組(均P<0.05)；模型組、甲巰咪唑組、夏枯草多糖組血清T4、T3及TRAb水平依次降低(均P<0.05)。見表1。

表1 4組小鼠血清T4、T3及TRAb水平比較(x±s)

2.3 4組小鼠血清干擾素γ、IL-6、IL-17 和TGF-β1 水平比較 模型組、夏枯草多糖組、甲巰咪唑組血清干擾素γ、IL-6、IL-17 和TGF-β1 水平均高于正常對(duì)照組(均P<0.05)；模型組、甲巰咪唑組、夏枯草多糖組血清干擾素γ、IL-6、IL-17 和TGF-β1水平均依次降低(均P<0.05)。見表2。

表2 4組小鼠血清干擾素γ、IL-6、IL-17 和TGF-β1 水平比較(x±s)

2.4 甲狀腺組織HE染色 正常對(duì)照組小鼠可見甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞成扁平狀，排列整齊，濾泡中充滿均勻的膠質(zhì)，濾泡間質(zhì)無充血。模型組小鼠甲狀腺濾泡增生，濾泡體積增大，不規(guī)則，上皮細(xì)胞也呈不規(guī)則狀，濾泡間質(zhì)有血管浸潤，濾泡腔內(nèi)膠質(zhì)不均勻，有向內(nèi)突出的結(jié)構(gòu)。夏枯草多糖組和甲巰咪唑組小鼠的甲狀腺組織結(jié)構(gòu)明顯恢復(fù)，濾泡增生減緩。見圖1。

正常對(duì)照組 模型組 夏枯草多糖組 甲巰咪唑組

2.5 4組小鼠甲狀腺組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 4組小鼠甲狀腺組織中Raf、MEK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組、夏枯草多糖組、甲巰咪唑組p-Raf、p-MEK1/2及p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組(均P<0.05)；模型組、甲巰咪唑組、夏枯草多糖組血清p-Raf、p-MEK及p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)水平均依次降低(均P<0.05)，見表3和圖2。

正常對(duì)照組 模型組 夏枯草多糖組 甲巰咪唑組

3 討 論

夏枯草為唇形科植物夏枯草的干燥果穗，是一種多年生草本植物，我國主要產(chǎn)于湖南、浙江、江蘇等地。夏枯草主要成分為三萜類、甾醇類、黃酮類和糖類等，其中夏枯草多糖為夏枯草的主要功效成分之一，研究已證實(shí)其具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗纖維化、抗癌和抗補(bǔ)體等生物活性[6-8]。Graves 病是一種以體液免疫(Th2)為主的自身免疫性疾病，通過TRAb和TSH調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞增殖，合成分泌激素[9]。目前針對(duì)Graves病的免疫研究多集中在CD4+T淋巴細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子功能的免疫調(diào)節(jié)等方面，CD4+T淋巴細(xì)胞識(shí)別甲狀腺自身抗原并與其受體相結(jié)合而被激活，從而產(chǎn)生各種黏附分子和細(xì)胞因子，并激活淋巴細(xì)胞和B細(xì)胞，產(chǎn)生自身抗體[10]。胸腺是CD4+T細(xì)胞分化發(fā)育的主要場(chǎng)所，與體液免疫、細(xì)胞免疫有著密切的關(guān)系，對(duì)于維護(hù)機(jī)體的免疫功能非常重要，而夏枯草多糖是一種良好的免疫調(diào)節(jié)劑[4]。故研究夏枯草多糖對(duì)Graves病的影響，將有助于闡釋夏枯草改善甲狀腺功能的相關(guān)機(jī)制。

本研究成功建立Graves病小鼠模型后，給予夏枯草多糖灌胃治療，發(fā)現(xiàn)夏枯草多糖可以緩解Graves病小鼠易動(dòng)、煩躁、互相攻擊及脫毛等癥狀，減少糞尿的排泄，同時(shí)可恢復(fù)Graves病小鼠甲狀腺結(jié)構(gòu)，減緩增生，并且效果較甲巰咪唑更為明顯。此外，甲狀腺相關(guān)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示，夏枯草多糖組血清T4、T3及TRAb 水平低于模型組及甲巰咪唑組，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)，提示夏枯草多糖抑制Graves病小鼠血清T4、T3及TRAb表達(dá)，減緩病情，且效果優(yōu)于甲巰咪唑，但還無法恢復(fù)至正常水平。

TSH主要通過PKA/ERK1/2途徑發(fā)揮大部分的生物學(xué)效應(yīng)，其中ERK1/2受體發(fā)生磷酸化調(diào)控甲狀腺激素的合成和分泌[11]。研究表明，ERK是MAPK家族的重要亞族之一，Ras/Raf/MEK/ERK為ERK信號(hào)通路經(jīng)典的激活途徑；ERK1/2是促進(jìn)細(xì)胞增殖的重要細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，抑制ERK通路對(duì)于改善甲狀腺細(xì)胞過度增殖至關(guān)重要[12-14]。Ras/Raf/MEK/ERK通路中，活化的Ras激活Raf，然后使MEK的兩個(gè)絲氨酸殘基磷酸化,活化其唯一的底物ERK1/2。活化的ERK形成二聚體，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，參與細(xì)胞的增殖、存活、分化和凋亡[15]。我們采用免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)法測(cè)定Graves病小鼠甲狀腺組織中Raf、MEK及ERK的表達(dá)量及其磷酸化水平發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠比較，Graves病小鼠甲狀腺組織中Raf、MEK1/2蛋白表達(dá)水平無明顯的變化，但其p-Raf、p-MEK及p-ERK蛋白表達(dá)水平升高，而夏枯草多糖組p-Raf、p-MEK及p-ERK蛋白表達(dá)水平均低于模型組及甲巰咪唑組(P<0.05)，這提示夏枯草多糖或通過抑制Raf、MEK及ERK的磷酸化調(diào)控RAS/Raf/MAPK/ERK信號(hào)通路，從而影響Graves病小鼠甲狀腺激素的合成和分泌，發(fā)揮緩解病情的作用。

李紅林等[16]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子干擾素γ、IL-6、IL-17、TGF-β1與游離T3、游離T4及TSH相關(guān)聯(lián)，協(xié)同參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致甲狀腺功能改變，引起Graves的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，Graves病小鼠血清中干擾素γ、IL-6、IL-17 及TGF-β1 水平均升高，而夏枯草多糖組血清細(xì)胞因子水平均低于模型組及甲巰咪唑組(P<0.05)，這提示夏枯草多糖可抑制Graves病小鼠血清中干擾素γ、IL-6、IL-17和TGF-β1的表達(dá)。

綜上所述，夏枯草多糖可能通過抑制Raf、MEK1/2及ERK1/2的磷酸化調(diào)控RAS/Raf/MAPK/ERK信號(hào)通路，從而抑制下游基因干擾素γ、IL-6、IL-17和TGF-β1的表達(dá)，影響Graves病小鼠甲狀腺激素的合成和分泌，減緩了Graves病癥。