高慧，劉松*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.3.2.13，transglutaminase,TGase),能催化蛋白質(zhì)肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基(?；w)轉(zhuǎn)移至賴氨酸殘基的ε-氨基(?；荏w)，形成ε-(γ-谷氨?；?賴氨酸共價鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)[1]。目前，TGase已被廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品和豆制品等蛋白類食品的質(zhì)構(gòu)改良[2]。隨著對其催化本質(zhì)認(rèn)識的加深，TGase的應(yīng)用開始向生物制藥[3]、制革、紡織[4]及生物技術(shù)[5]等多個非食品領(lǐng)域拓展。1989年，日本天野公司首次從土壤中分離了1株能夠分泌TGase的茂源鏈霉菌(Streptomycesmobaraensis)[6]。與其他來源的TGase相比，微生物發(fā)酵生產(chǎn)的TGase具有非Ca2+依賴性的特點(diǎn)，且生產(chǎn)周期短，成本優(yōu)勢明顯。隨著應(yīng)用領(lǐng)域的拓展，鏈霉菌TGase的產(chǎn)量及酶學(xué)性質(zhì)(底物特異性及熱穩(wěn)定性)的研究逐漸限制了對它的應(yīng)用需求。構(gòu)建高產(chǎn)TGase的基因工程菌，并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)改造成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

鏈霉菌TGase是一種胞外酶，在野生菌中以無活性的酶原(pro-TGase)形式分泌，pro-TGase被內(nèi)源的蛋白酶切除N端酶原區(qū)后，轉(zhuǎn)化成活性TGase。由于N端酶原區(qū)對TGase的正確折疊及分泌有重要影響[7-9]，通常其在異源宿主中需以pro-TGase形式表達(dá)。值得注意的是，細(xì)菌和真菌異源表達(dá)宿主通常缺少能專一切割pro-TGase酶原區(qū)的蛋白酶。因此，如何將pro-TGase高效轉(zhuǎn)化為活性TGase成為其異源表達(dá)的關(guān)鍵。目前，主要有3種策略獲得活性重組TGase：(1)共表達(dá)pro-TGase與特異性蛋白酶(SAM-P45[10]或人鼻病毒3C蛋白酶[11])；(2)共表達(dá)酶原區(qū)與TGase[8,12-13]；(3)僅表達(dá)pro-TGase，體外添加活化蛋白酶[14]。由于共表達(dá)蛋白酶可以對TGase的持續(xù)降解[10]或缺少共價連接的酶原區(qū)促進(jìn)其分泌[12]，該策略獲得的TGase表達(dá)量(16.30 U/mL)[15]仍遠(yuǎn)低于僅表達(dá)pro-TGase獲得的(51.1 U/mL)[14]。因此，僅表達(dá)pro-TGase再體外添加蛋白酶活化的策略，對于制備活性TGase仍具有產(chǎn)量和成本優(yōu)勢。

目前，用于切割N端酶原區(qū)使pro-TGase活化的蛋白酶可以從產(chǎn)TGase的野生菌中分離(如S.mobaraensis金屬蛋白酶TAMEP)[16-17]或其他鏈霉菌中提取(如Streptomycesalbogriseolus分泌的SAM-P20、SAM-P26及SAM-P45等)[18]。此外，一系列商品化的蛋白酶同樣能活化pro-TGase，如dispase、中性蛋白酶和胰蛋白酶等[19]。與其他的蛋白酶相比，S.mobaraensis來源的TAMEP能夠精準(zhǔn)地切割pro-TGase的N端酶原區(qū)，活化效率更高且不會對活化后的TGase進(jìn)行持續(xù)降解[20]。研究發(fā)現(xiàn)，S.mobaraensis來源TAMEP屬M(fèi)4蛋白酶，在野生菌中僅有少量分泌至胞外，且活性受到鏈霉菌、枯草桿菌蛋白酶抑制劑的抑制[16,20-21]。最近，S.mobaraensisTAMEP被成功表達(dá)于大腸桿菌，但僅存在于細(xì)胞周質(zhì)空間，并不利于其大規(guī)模發(fā)酵制備[20]?；诖耍瑢?shí)現(xiàn)TAMEP高效分泌表達(dá)將有助于降低重組pro-TGase的活化成本，提高TGase生產(chǎn)效率。

本研究將來源于S.mobaraensis的TAMEP表達(dá)于大腸桿菌，通過信號肽類型優(yōu)化、信號肽N端密碼子同義替換及誘導(dǎo)條件優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了TAMEP的高效分泌，并分析了其酶學(xué)性質(zhì)及對pro-TGase的活化效率。研究結(jié)果將有助于TAMEP的規(guī)?；苽洹?/p>

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株與質(zhì)粒：表達(dá)質(zhì)粒pET-22b(+)、大腸桿菌EscherichiacoliJM109和E.coliBL21(DE3)由本實(shí)驗室保存。產(chǎn)S.mobaraensispro-TGase的生產(chǎn)菌Yarrowialipolytica/pINA1297/TGase由本實(shí)驗前期構(gòu)建[22]。編碼S.mobaraensisTAMEP及天然信號肽TSP基因[20]的質(zhì)粒pUC18/TSP-TAMEP由上海生工合成。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物 5，胰蛋白胨10，NaCl 10。TB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 12，酵母提取物 24，K2HPO4·3H2O 16.37，KH2PO42.31，甘油 5。Y.lipolytica發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油 15，酵母膏 20，NH4Cl 2.64，KH2PO40.32，MgSO40.25，維生素B13.34×10-4，調(diào)pH至8.0。YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20。LB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基在接種前需加入終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的氨芐青霉素。

酶、試劑、引物和DNA測序：限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶購自Takara公司。dispase、GSH、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒和抗生素購自上海生工公司。Z-Gln-Gly-OH、L-谷氨酸-γ-單羥肟酸、組氨酸標(biāo)簽蛋白抗體和顯色劑購自賽默飛公司。BCA蛋白濃度檢測試劑盒和SDS-PAGE試劑盒購于碧云天公司。引物構(gòu)建、DNA測序由上海生工公司完成。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 TAMEP表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

以pUC18/TAMEP為模板，分別用引物對TSPTAMEP1/TAMEP2和TAMEP1/TAMEP2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段TSP-TAMEP(天然信號肽TSP基因+TAMEP基因)和TAMEP。PCR反應(yīng)條件為： 98 ℃預(yù)變性90 s；隨后進(jìn)行30個循環(huán)擴(kuò)增(98 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s)；最后72 ℃保溫5 min。將TSP-TAMEP和TAMEP分別克隆至pET-22b(+)的NdeI-XhoI和NcoI-XhoI酶切位點(diǎn)，得到表達(dá)載體pET22b-TSP-TAMEP和pET22b-pelB-TAMEP。將所得表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，得到重組菌E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)和E.coliBL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)。質(zhì)粒構(gòu)建相關(guān)引物見表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 優(yōu)化TAMEP信號肽N端密碼子同義隨機(jī)替換

以Mut-A1、Mut-A2、Mut-A3、Mut-A4、Mut-A5、Mut-A6、Mut-A7、Mut-A8為上游引物，以Mut-B為下游引物，對pET22b-TSP-TAMEP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在TAMEP信號肽TSP的 N端前10個氨基編碼基因中隨機(jī)引入同義密碼子。PCR反應(yīng)條件為： 98 ℃預(yù)變性90 s；隨后進(jìn)行30個循環(huán)擴(kuò)增(98 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min)；最后72 ℃保溫5 min。PCR產(chǎn)物混合，并經(jīng)DpnI處理后轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后涂布氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板。挑取轉(zhuǎn)化子至含LB培養(yǎng)基的96深孔板中培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)8 h；轉(zhuǎn)接裝有TB培養(yǎng)基的96深孔板，37 ℃培養(yǎng)2 h，加入終濃度10 μmol/L IPTG，20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)40 h。將高產(chǎn)轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接搖瓶培養(yǎng)復(fù)篩。

1.2.3 重組菌發(fā)酵優(yōu)化

重組大腸桿菌發(fā)酵：取TAMEP生產(chǎn)菌液100 μL接入LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)10 h轉(zhuǎn)接至TB培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)；當(dāng)菌體OD600達(dá)到一定值(0.5～3.0)時，加入一定量的IPTG(0～200 μmol/L)，同時降溫培養(yǎng)(16～30 ℃)培養(yǎng)40 h；為提高TAMEP胞外表達(dá)水平，分別添加2～10 g/L的甘氨酸、葡萄糖或體積分?jǐn)?shù)為0.2%～1.0%乙醇。各培養(yǎng)基使用前添加終質(zhì)量濃度50 μg/mL的氨芐青霉素。

重組Y.lipolytica發(fā)酵：將pro-TGase生產(chǎn)菌液接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)24 h；將種子液以10%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃搖瓶培養(yǎng)120 h。

1.2.4 蛋白質(zhì)分離純化

采用鎳柱對TAMEP及pro-TGase進(jìn)行純化。重組菌發(fā)酵上清液經(jīng)0.22 μmol/L膜過濾制成上樣樣品。將樣品注入經(jīng)結(jié)合緩沖液平衡的鎳柱，并用結(jié)合緩沖液洗去未結(jié)合蛋白；隨后以0～500 mmol/L咪唑溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集含有TAMEP或TGase催化活性的部分(pro-TGase樣品經(jīng)dispase活化)。所得純化樣品經(jīng)脫鹽柱去除鹽離子。

1.2.5 TAMEP酶學(xué)性質(zhì)檢測

最適反應(yīng)溫度：在反應(yīng)溫度為20～80 ℃測定TAMEP活性，以所測得的最高酶活力為100%，計算其他反應(yīng)溫度下的相對酶活力。

最適反應(yīng)pH：測定pH為5～10條件下TAMEP活性(pH 5：50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；pH 6～8：50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液；pH 9～10：50 mmol/L甘氨酸-NaOH緩沖液)，以所測得的最高活性為100%，計算其他反應(yīng)pH下的相對酶活力。

熱穩(wěn)定性：將TAMEP分別于30～60 ℃下孵育0～60 min后，冰水浴5 min并測定其催化活性，未經(jīng)熱處理的酶活力設(shè)為100%，計算其他條件下的相對酶活力。

pH穩(wěn)定性：將TAMEP用pH為5～10緩沖液稀釋相同倍數(shù)，于30 ℃水浴中孵育60 min測定酶活力，以測得最高酶活力為100%，計算其他pH下孵育的相對酶活力。

1.2.6 pro-TGase活化分析

將純化的pro-TGase與不同濃度的TAMEP溶液混合均勻，于37 ℃恒溫30 min。在該反應(yīng)體系中，pro-TGase濃度為6.91 μmol/L，TAMEP濃度分別為0.133、0.066、0.033和0.017 μmol/L。反應(yīng)開始后，每間隔10 min取樣50 μL，進(jìn)行TGase活力測定；同時取樣10 μL與SDS-PAGE電泳上樣緩沖液混合于90 ℃加熱10 min后進(jìn)電泳分析。

1.2.7 酶活力檢測

按照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中福林法測蛋白酶活性方法測定TAMEP酶活力。1 U TAMEP酶活力定義為40 ℃下每1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量。以用α-N-CBZ-Gln-Gly和鹽酸羥胺為作用底物測定TGase酶活力[7]。1 U TGase酶活力定義為37 ℃每1 min催化生成1 μmolL-谷氨酸-γ-單羥肟酸的酶量。

1.2.8 蛋白質(zhì)分析

使用BCA蛋白濃度檢測和采用碧云天試劑盒制備SDS-PAGE電泳凝膠，具體操作參考產(chǎn)品說明書。使用濃縮膠質(zhì)量濃度為50 g/L，分離膠質(zhì)量濃度為120 g/L，以質(zhì)量濃度1 g/L考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色。使用His-tag標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot，具體方法參考前期工作[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 信號肽來源優(yōu)化提高TAMEP在E. coli中的分泌表達(dá)

在E.coli中，融合于N端的信號肽可介導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌[24]。因此，分別將TAMEP天然信號肽[20]和大腸桿菌pelB信號肽融合至TAMEP的N端，構(gòu)建得到表達(dá)質(zhì)粒pET22b-TSP-TAMEP和pET22b-pelB-TAMEP(圖1)。轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)分別得到重組菌E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)和E.coliBL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)。

圖1 表達(dá)質(zhì)粒示意圖Fig.1 The scheme of expression plasmids

將E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)、E.coliBL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)及對照菌E.coliBL21(DE3)(pET-22b(+))于TB培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)起始菌體濃度(OD600)、IPTG濃度和誘導(dǎo)時間，分別為20 ℃、0.8、100 μmol/L和40 h。如圖2-a所示，使用TAMEP天然信號肽的重組菌胞外蛋白酶活力達(dá)到20.8 U/mL，較pelB信號肽條件下酶活力提高92.6%；由于存在一定量的內(nèi)源蛋白酶，對照菌仍能檢測到一定的蛋白酶活力。由于胞外蛋白酶條帶較多，TAMEP的條帶在SDS-PAGE電泳圖中并不清晰(圖2-b)。Western Blot分析結(jié)果顯示，在E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)、E.coliBL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)發(fā)酵上清液中均能檢測到條帶，且與TAMEP理論分子質(zhì)量56.4 kDa接近(圖2-c)。對照E.coliBL21(DE3)(pET-22b(+))樣品，未能檢測到相同條帶(圖2-c)。上述結(jié)果表明，TAMEP天然信號肽能有效介導(dǎo)TAMEP在E.coliBL21(DE3)中的分泌，且性能優(yōu)于E.coli內(nèi)源信號肽pelB。

a-重組菌胞外TAMEP酶活力；b-重組菌胞外SDS-PAGE電泳；c-重組菌胞外Western BlotM-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；1-E. coli BL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)；2-E. coli BL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)；3-E. coli BL21(DE3)(pET-22b(+))圖2 分泌信號肽類型對TAMEP表達(dá)的影響Fig.2 Type of signal peptide on the expression of TAMEP注：TAMEP位置用箭頭標(biāo)出

2.2 信號肽N端密碼子同義突變提高TAMEP在E. coli中的表達(dá)

研究表明，蛋白質(zhì)N端編碼區(qū)基因序列對其表達(dá)效率有重要影響，但確切的機(jī)制尚不清楚[25-26]。為進(jìn)一步提高TAMEP在E.coli中的表達(dá)，基于pET22b-TSP-TAMEP對TAMEP天然信號肽N端前10個氨基酸的密碼子進(jìn)行隨機(jī)同義突變(圖1)，并轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)。通過微孔板對1 656個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初篩，選取了20株蛋白酶活力較高的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。如圖3-a所示，20株菌中17株菌的酶活力較E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)高；其中，菌株17較出發(fā)菌提高了30%，達(dá)到了27.0 U/mL?；蛐蛄蟹治鲲@示，上述17株菌中TAMEP信號肽N端的前10個氨基酸編碼基因均發(fā)生了不同程度的同義突變。

a-突變株搖瓶發(fā)酵上清液TAMEP酶活力;b-突變株TAMEP信號肽N端基因序列WT-E. coli BL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)；1-17-TAMEP信號肽N端密碼子同義突變體圖3 信號肽N端前10個氨基酸密碼子同義突變對TAMEP在E. coli中表達(dá)的影響Fig.3 Effect of synonymous mutation within first 10 residuesof the TAMEP signal peptide on its expression in E.coli

2.3 提高TAMEP在E.coli中表達(dá)的發(fā)酵條件優(yōu)化

為提高TAMEP在E.coliBL21(+)中的表達(dá)量，通過單因素實(shí)驗依次對上述17株菌的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑IPTG濃度、誘導(dǎo)起始菌體濃度及添加劑進(jìn)行優(yōu)化。如圖4所示，對TAMEP分泌表達(dá)影響最大的是添加劑，其次為誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑濃度；誘導(dǎo)起始菌體濃度對酶表達(dá)的影響最小。在所選的添加劑中，乙醇能夠刺激細(xì)胞熱休克蛋白的表達(dá)，防止所表達(dá)蛋白的錯誤折疊；葡萄糖可提高宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒穩(wěn)定性；甘氨酸、曲通及吐溫等可以改善細(xì)胞膜通透性，提高重組蛋白向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)的效率[27]。葡萄糖對TAMEP分泌表達(dá)的促進(jìn)作用最大，表明質(zhì)粒穩(wěn)定性可能是其高效表達(dá)的限制性因素。最終確定TAMEP在E.coli中高效分泌表達(dá)的條件為：誘導(dǎo)溫度20 ℃、IPTG濃度為10 μmol/L、誘導(dǎo)起始OD600值為1.5及添加10 g/L葡萄糖。在此條件下，胞外TAMEP酶活力達(dá)到186.3 U/mL，較優(yōu)化前提高了5.9倍。

2.4 TAMEP的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

本研究中表達(dá)的重組TAMEP和前期研究中表達(dá)的重組pro-TGase均在C端添加了由6個組氨酸構(gòu)成的His-tag，故采用鎳柱對這2個蛋白進(jìn)行親和純化。經(jīng)洗脫條件優(yōu)化，確定TAMEP和pro-TGase洗脫的咪唑濃度分別為50和250 mol/L。如圖5所示，純化的蛋白無明顯雜帶。經(jīng)脫鹽柱去除咪唑，測定TAMEP比酶活力為437 U/mg。

a-誘導(dǎo)溫度TAMEP表達(dá)的影響；b-IPTG濃度TAMEP表達(dá)的影響；c-誘導(dǎo)起始菌株濃度TAMEP表達(dá)的影響；d-添加劑TAMEP表達(dá)的影響圖4 誘導(dǎo)表達(dá)條件對TAMEP表達(dá)的影響Fig.4 Effects of induction conditions on the TAMEP expression

M-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；1-純化TAMEP 50 mol/L洗脫液；2-純化pro-TGase 250 mol/L洗脫液圖5 SDS-PAGE電泳分析TAMEPFig.5 SDS-PAGE analysis of TAMEP注：TAMEP和pro-TGase位置分別用單箭頭和雙箭頭標(biāo)出(下同)

對純化后的TAMEP進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)分析。如圖6-a和圖6-b所示，TAMEP的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH分別為55 ℃和7.0。穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示，TAMEP在30～50 ℃孵育60 min酶活力保持在50%以上，60 ℃孵育相同時間酶活力幾乎全部損失(圖6-c)；TAMEP在pH 6.2～8.9最穩(wěn)定，并且在堿性環(huán)境中比在酸性環(huán)境中更穩(wěn)定。上述性質(zhì)與S.mobaraensisTAMEP相似，將有助于高效活化pro-TGase的同時，確保活化后TGase的穩(wěn)定性。

a-溫度對TAMEP催化活性影響；b-pH對TAMEP催化活性影響；c-溫度對TAMEP穩(wěn)定性影響；d-pH對TAMEP穩(wěn)定性影響圖6 TAMEP酶學(xué)性質(zhì)分析Fig.6 Catalytic property analysis of TAMEP

2.5 TAMEP活化pro-TGase

為研究重組TAMEP對pro-TGase的活化，用0.017～0.133 μmol/L TAMEP活化6.91 μmol/L pro-TGase 30 min，每隔10 min取樣進(jìn)行TGase酶活力檢測和電泳分析。TGase酶活力分析顯示，TGase活性隨著活化反應(yīng)進(jìn)行而逐漸升高；相同的活化時間下，TGase活性隨著加入TAMEP的濃度升高而升高(圖7-a)。

如圖7-b所示，隨著活化反應(yīng)的進(jìn)行，pro-TGase(43.4 kDa)迅速轉(zhuǎn)化為TGase(39.2 kDa)，較高濃度TAMEP可加快這個轉(zhuǎn)化過程，并且未產(chǎn)生其他小的蛋白條帶。上述結(jié)果表明，重組TAMEP能高效催化pro-TGase活化，并不會降解活化后的TGase。

a-TGase酶活；b-SDS-PAGE電泳圖7 重組TAMEP的濃度對pro-TGase活化的影響Fig.7 Effect of TAMEP concentration on theactivation of pro-TGase注：SDS-PAGE左側(cè)括號中的數(shù)值為TAMEP濃度

3 結(jié)論與討論

重組鏈霉菌pro-TGase異源表達(dá)后，需要高效且專一性強(qiáng)的活化蛋白將其轉(zhuǎn)化為活性TGase。S.mobaraensisTAMEP作為pro-TGase天然活化蛋白，較其他蛋白酶更具優(yōu)勢。本研究，我們將S.mobaraensis來源的TAMEP表達(dá)于E.coli，并通過多重優(yōu)化策略(信號肽類型、N端同義密碼子優(yōu)化、優(yōu)化誘導(dǎo)條件)，實(shí)現(xiàn)了TAMEP的高效分泌表達(dá)，胞外TAMEP酶活力達(dá)到了186.3 U/mL。與胞內(nèi)表達(dá)相比[20]，高效分泌表達(dá)將有助于TAMEP的分離提取，降低產(chǎn)酶成本。酶學(xué)性質(zhì)分析顯示，重組TAMEP 與TGase具有近似穩(wěn)定pH和溫度范圍，將有助于前者對后者的活化。研究結(jié)果為TAMEP規(guī)?；a(chǎn)提供了生產(chǎn)菌株和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。值得注意的是，本研究采用價格較高的IPTG作為誘導(dǎo)劑，同時活化過程中TAMEP不能重復(fù)利用。因此，進(jìn)一步考查自誘導(dǎo)表達(dá)的條件及研究TAMEP的固化策略將有助于其工業(yè)化應(yīng)用。