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        高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定海藻中5種砷形態(tài)

        2020-08-20 00:43:30陳露嵇晶金佳穎鄭麗杰韓威王欣之劉睿吳皓
        食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年15期
        關(guān)鍵詞:方法

        陳露,嵇晶,金佳穎,鄭麗杰,韓威,王欣之,3*,劉睿,3,吳皓,3*

        1(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 南京, 210023) 2(江蘇省海洋藥用生物資源研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京, 210023)3(江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京, 210023)

        海藻是我國(guó)出口創(chuàng)匯的重要海產(chǎn)品,深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛(ài),含有豐富的碘、膳食纖維、蛋白質(zhì)、多糖、多酚、甾醇等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和活性物質(zhì)[1-3],具有潛在的經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)價(jià)值[4-6]。海藻由于細(xì)胞壁的多孔結(jié)構(gòu)及自身機(jī)制極易富集水中的砷,被稱(chēng)為海洋生態(tài)系統(tǒng)的“砷庫(kù)”。砷在自然界存在著不同的形態(tài),毒性由大到小依次為:亞砷酸根(As3+)>砷酸根(As5+)>一甲基砷(monomethylated arsenic,MMA)>二甲基砷(dimethylated arsenic,DMA)>砷甜菜堿(arsenobetaine,AsB)[7],無(wú)機(jī)砷毒性(As3+和As5+)大于有機(jī)砷(MMA和DMA),AsB則無(wú)毒[8]。因此分析海藻中砷的存在形式及有機(jī)砷、無(wú)機(jī)砷的比例,是評(píng)價(jià)海藻是否可食用或藥用的重要參照依據(jù)。

        目前砷形態(tài)的分析技術(shù)有很多[9-12],高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry,HPLC-ICP-MS)具有檢出限低、靈敏度高和線性范圍寬的優(yōu)勢(shì),已成為目前最常用且有效的方法之一,被廣泛應(yīng)用于不同基質(zhì)[13-16]的砷形態(tài)分析。在分析前需對(duì)樣品進(jìn)行提取,常用提取方法為水[17]、不同比例的甲醇-水[18]、鹽酸[19]、硝酸[20]、酶試劑[21]等提取液結(jié)合超聲提取、微波消解、熱浸提等方法,對(duì)不同的樣品選擇合適的提取方式,保證較高的提取率。不同的方法均有優(yōu)缺點(diǎn),如酶解法適合蛋白質(zhì)含量較高的肉類(lèi);甲醇提取法若濃度過(guò)高會(huì)降低儀器的使用壽命;鹽酸中的Cl與Ar形成40Ar35Cl 從而干擾75As的測(cè)定[22],因此選擇合適的提取方法是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。

        本研究采用HPLC-ICP-MS技術(shù)以銅藻中5種形態(tài)砷的提取量及總砷提取率為指標(biāo),對(duì)比GB 5009.11—2014[23]及GB/T 23372—2009[24]中規(guī)定的試樣提取方法,對(duì)提取劑濃度、溫度進(jìn)行優(yōu)化,并將優(yōu)化得到的方法對(duì)不同海藻(海帶、裙帶菜、羊棲菜、鼠尾藻)進(jìn)行分析,以期為海藻的食用安全、品質(zhì)把控及標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        各海藻信息如表1所示。亞砷酸根(As3+)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08666)、二甲基砷(DMA)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08669)、一甲基砷(MMA)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08668)、砷酸根(As5+)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08667)、砷甜菜堿(AsB)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08670),中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院;甲醇(色譜級(jí)),美國(guó)天地;HNO3、NH4H2POm4(優(yōu)級(jí)純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他提取用試劑均為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純。

        MARS微波消解儀,美國(guó)CFM公司;NEXIOH 350D電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、Series 200高效液相,美國(guó)Perkin Elmer公司。

        表1 藻樣品的采集海域、日期及來(lái)源Table 1 Sea area,date and source of seaweed samples

        1.2 儀器條件

        色譜柱為Hamilton PRP-X100(250 mm×4.1 mm,10 μm)陰離子交換色譜柱。體積流量1 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量50 μL;流動(dòng)相A:25 mmol/L NH4H2PO4溶液(氨水調(diào)至pH=8);流動(dòng)相B:水;梯度洗脫:0~15 min,100%~0%水;16~19 min,0%~100%水;20~24 min,100%水。

        ICP-MS條件:高頻等離子體發(fā)射功率,1 550 W;載氣為高純氬氣;同心霧化器;載氣流速0.85 L/min;氣補(bǔ)償氣流量0.15 L/min;采樣深度9.5 mm;采集75As;蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速0.3 r/min。

        1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

        分別精密稱(chēng)取AsB、As3+、DMA、MMA、As5+標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,加水配制成1 000 ng/mL (以砷計(jì))的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,加水配制成一系列梯度濃度(均以砷計(jì))的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

        1.4 樣品前處理

        1.4.1 總砷的測(cè)定方法

        按照GB 5009.268—2016中[25]規(guī)定的“第一法 電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)”進(jìn)行檢測(cè)。

        1.4.2 海藻樣品砷形態(tài)分析

        硝酸-熱浸提:按GB 5009.11—2014[23]中規(guī)定的“試樣提取”方法對(duì)銅藻進(jìn)行處理后,進(jìn)HPLC-ICP-MS檢測(cè)。

        水-超聲提取:按GB/T 23372—2009[24]中規(guī)定的“植物性固體樣品”提取方法對(duì)銅藻進(jìn)行處理后,進(jìn)HPLC-ICP-MS檢測(cè)。

        優(yōu)化后提取方法:取適量海藻樣品,加入20倍體積0.30 mol/L硝酸,在100 ℃恒溫箱內(nèi)浸提2.5 h,每隔0.5 h取出振蕩1 min,冷卻至室溫,在8 000 r/min下離心15 min,取上清液過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜,進(jìn)HPLC-ICP-MS測(cè)定。

        1.5 數(shù)據(jù)分析處理

        數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差極性檢驗(yàn),符合兩者檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,兩兩比較用LSD檢驗(yàn);不符合則采用Kruskal-Wallis 多重比較。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 銅藻中總砷的含量

        通過(guò)ICP-MS對(duì)10個(gè)海藻樣品中總砷含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表2,不同海藻對(duì)于砷的富集量有顯著差異,各個(gè)海藻中總砷的含量均超出GB 2762—2017《食品中污染物限量》[26]中規(guī)定總砷最高允許限量(0.5 mg/kg)的40~200倍。不同海域同種海藻之間總砷含量存在顯著性差異,如鼠尾藻(S)、裙帶菜(Q),可能與不同海域受污染程度不同有關(guān);同個(gè)海域不同采收時(shí)間的海藻中的總砷含量也存在顯著性差異,如海帶(H)、裙帶菜(Q1,Q3),可能與海藻在海水中富集砷的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。海藻易富集海水中的砷,砷具有多種不同的形態(tài),若用總砷評(píng)價(jià)海藻的食用安全顯得十分局限,所以有必要對(duì)海藻中砷形態(tài)進(jìn)行分離,確定有機(jī)砷及無(wú)機(jī)砷的比例,從而為評(píng)價(jià)海藻的食用安全提供依據(jù)。

        表2 不同海藻中總砷含量的測(cè)定 單位:mg/kg

        2.2 提取方法的選擇

        本文對(duì)比分析GB 5009.11—2014中規(guī)定的硝酸-熱浸提法和GB/T 23372—2009中規(guī)定的水-超聲提取法對(duì)銅藻中5種形態(tài)砷的提取量的影響,結(jié)果如表3所示。

        表3 不同提取方法對(duì)銅藻中5種形態(tài)砷提取量的影響

        由表3可知,硝酸-熱浸提對(duì)銅藻中5種形態(tài)砷的提取總量為56.61 mg/kg,其提取率達(dá)71.19%,而水-超聲提取法對(duì)應(yīng)的提取率僅為40.87%;硝酸-熱浸提法能提取得到各種砷形態(tài),而水-超聲法不能提取得到As3+;硝酸-熱浸提所提取的AsB、As3、As5+含量均明顯高于水-超聲提取法。綜合考慮,選用硝酸-熱浸提法作為海藻砷形態(tài)分析的提取方法。

        2.3 提取條件優(yōu)化

        2.3.1 最佳提取溫度的確定

        在HNO3濃度為0.15 mol/L時(shí),考察提取溫度分別為70、80、90、100 ℃對(duì)銅藻中5種形態(tài)砷提取量的影響,結(jié)果表4所示。由表4可知,隨著提取溫度的升高銅藻中總砷的提取率呈上升的趨勢(shì),100 ℃時(shí)提取率達(dá)最大為74.71%; 銅藻中DMA、MMA含量較低,當(dāng)提取溫度為70、80 ℃ 時(shí),不能提取得到MMA,DMA提取量隨提取溫度的升高其變化趨勢(shì)不明顯,As5+提取量受提取溫度的影響不明顯;AsB和As3+的提取量隨提取溫度增加呈上升的趨勢(shì),當(dāng)提取溫度達(dá)100 ℃時(shí),與70 ℃相比AsB、As3+提取量分別上升了53.08%、66.26%。因此本實(shí)驗(yàn)確定最佳提取溫度為100 ℃。

        表4 不同提取溫度對(duì)銅藻中5種形態(tài)砷提取量的影響

        2.3.2 最佳硝酸濃度的確定

        在提取溫度為90 ℃,考察濃度分別為0、0.15、0.30、0.45 mol/L的硝酸溶液對(duì)銅藻中5種形態(tài)砷提取量的影響,結(jié)果如表5所示。

        表5 不同硝酸濃度對(duì)銅藻中5種形態(tài)砷提取量的影響

        由表5可知,隨著提取液濃度的增加,銅藻中總砷的提取率呈先上升后降低的趨勢(shì);當(dāng)HNO3濃度為0.30 mol/L時(shí),總砷提取率最高為86.09%,且在該濃度下,AsB、As3+、MMA提取量均最高;DMA提取量整體變化趨勢(shì)均不明顯,As5+的提取量隨濃度的升高而增加;在HNO3濃度為0.45 mol/L時(shí),As3+的提取量降低,而As5+的提取量上升,可能是HNO3濃度過(guò)高使低價(jià)的As3+氧化為高價(jià)態(tài)的As5+;綜上,選擇HNO3溶液濃度為0.3 mol/L為最佳濃度。

        2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

        2.4.1 線性關(guān)系考察

        將一系列不同質(zhì)量濃度的5種形態(tài)砷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按上述色譜條件取50 μL進(jìn)HPLC-ICP-MS分析,測(cè)定結(jié)果以各形態(tài)砷的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X,以響應(yīng)值為縱坐標(biāo)Y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程見(jiàn)表6。

        表6 五種形態(tài)砷的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)Table 6 Linear ranges,regression equations andcorrelation coefficients of the five arsenic species

        2.4.2 精密度、重復(fù)性及加標(biāo)回收率考察

        取質(zhì)量濃度為100 ng/mL各形態(tài)砷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)在HPLC上進(jìn)樣6次,計(jì)算RSD值,AsB、As3+、DMA、MMA、As5+的RSD分別為1.56%、2.22%、1.58%、1.60%、5.79%。取適量銅藻粉末,按硝酸-熱浸提的提取條件進(jìn)行處理,共6份,進(jìn)HPLC分析,計(jì)算RSD值,AsB、As3+、DMA、MMA、As5+的RSD分別為3.74%、8.42%、12.64%、8.86%、2.66%。取銅藻樣品6份,分別加入砷標(biāo)準(zhǔn)混合溶液適量,按優(yōu)化后的提取條件進(jìn)行處理,計(jì)算加標(biāo)回收率,5種形態(tài)砷的平均回收率為79.50%~115.73%,RSD均低于15%。

        2.5 海藻中5種形態(tài)砷含量測(cè)定

        按優(yōu)化后的方法對(duì)不同海藻中5種形態(tài)砷含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表7所示。5種海藻中DMA、MMA含量均較低,毒性較大的無(wú)機(jī)砷在5種海藻中占比各有不同。T1銅藻中以As5+含量最高,無(wú)毒性的AsB次之,DMA含量最低,其中無(wú)機(jī)砷占總砷含量的58.39%,僅次于Y1羊棲菜。海帶(H)、裙帶菜(Q)中無(wú)機(jī)砷占比較低,約占總砷含量的15%,主要以無(wú)毒性的AsB形式存在,這與常家琪[27]、高繼慶[28]的研究一致;Q2裙帶菜中無(wú)機(jī)砷的占比低于T1銅藻及Y1羊棲菜(P<0.05);Y1羊棲菜中AsB的占比低于Q2裙帶菜及H1海帶(P<0.05);羊棲菜(Y)砷主要以毒性較大的無(wú)機(jī)砷形式存在,占提取總砷的50%~60%,與文獻(xiàn)研究[29-30]一致;鼠尾藻中無(wú)機(jī)砷約占提取總砷的40%。按我國(guó)現(xiàn)行農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1709—2011《綠色食品 藻類(lèi)及其制品》[31]中規(guī)定藻類(lèi)中無(wú)機(jī)砷限量應(yīng)≤1.5 mg/kg,則所測(cè)的海藻樣品中無(wú)機(jī)砷含量均超標(biāo),其中銅藻、羊棲菜、鼠尾藻嚴(yán)重超標(biāo),海帶、裙帶菜超標(biāo)量較少。

        表7 不同海藻中5種形態(tài)砷的含量測(cè)定

        100 ng/mL的5種形態(tài)砷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(A),銅藻(T1)、海帶(H2)、鼠尾藻(S1)、羊棲菜(Y1)、裙帶菜(Q3)的色譜圖見(jiàn)圖1。從圖1可知,各形態(tài)砷峰形尖銳且能完全分離,靈敏度較高,說(shuō)明該方法滿(mǎn)足海藻砷形態(tài)分析的要求。

        1-AsB;2-As3+;3-DMA;4-MMA;5-As5+圖1 100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)及編號(hào)為T(mén)1、H2、S1、Y1、Q3海藻中5種砷形態(tài)色譜圖Fig.1 Chromatograms of the five arsenic species in 100 ng/mL mixed standard solution (A) and T1,H2,S1,Y1,Q3 seaweed

        3 結(jié)論與討論

        本研究建立了海藻中AsB、As3+、DMA、MMA和As5+等5種砷形態(tài)分析測(cè)定的HPLC-ICP-MS方法,并進(jìn)行優(yōu)化,確定以0.3 mol/L硝酸溶液為提取劑,樣品在提取溫度為100 ℃條件下提取為最優(yōu)條件,該提取方法操作簡(jiǎn)便、快捷,總砷提取率較高;用所建立的分析方法對(duì)銅藻、海帶、裙帶菜、鼠尾藻、羊棲菜進(jìn)行分析。結(jié)果表明,銅藻中以As5+含量最高,無(wú)毒性的AsB含量次之,DMA含量最低,其中毒性大的無(wú)機(jī)砷占提取總砷含量的58.39%;海帶、裙帶菜中砷化合物主要以無(wú)毒性的AsB形式存在;羊棲菜、鼠尾藻中無(wú)機(jī)砷占比分別約為50%~70%、40%;各海藻中毒性大的無(wú)機(jī)砷均超過(guò)NY/T 1709—2011《綠色食品 藻類(lèi)及其制品》中規(guī)定的最高允許限量,其中銅藻、羊棲菜、鼠尾藻超標(biāo)嚴(yán)重。

        海藻中無(wú)機(jī)砷超標(biāo)嚴(yán)重,其食用安全性引起消費(fèi)者的關(guān)注。但目前對(duì)攝入海藻后不同形態(tài)砷化合物在體內(nèi)代謝途徑的探討不夠深入,且對(duì)海藻無(wú)機(jī)砷的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估還不完善,后續(xù)應(yīng)對(duì)砷化合物的毒理學(xué)評(píng)價(jià)及風(fēng)險(xiǎn)分析進(jìn)行深入研究,同時(shí)加強(qiáng)對(duì)海藻中無(wú)機(jī)砷含量的監(jiān)測(cè),為科學(xué)指導(dǎo)海藻的食用安全提供依據(jù)。

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