高夢迪,盛茂銀,3*

(1.貴州師范大學(xué) 喀斯特研究院,貴州 貴陽 550001;2.國家喀斯特石漠化治理工程技術(shù)研究中心,貴州 貴陽 550001;3.貴州省喀斯特石漠化防治與衍生產(chǎn)業(yè)工程實驗室,貴州 貴陽 550001)

0 引言

納米材料是指由極細晶粒組成、特征維度尺寸在納米量級(0.1～100 nm)的固體材料。由于納米材料具有小尺寸效應(yīng)、表面界面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和量子隧道效應(yīng)等特殊的物理化學(xué)特性，故在諸多領(lǐng)域都被關(guān)注[1]。鈦(Ti)是一種對植物有顯著影響的有益元素，與許多其他重金屬一樣，在低濃度處理下，對植物的生長發(fā)育具有促進作用，而在高劑量下處理，對植物具有毒性作用[2]。納米TiO2作為一種常見的金屬氧化物納米材料，具有無毒、催化活性高、穩(wěn)定性好以及抗氧化能力強等優(yōu)點，在化妝品制造、生物制藥、空氣凈化和廢水處理等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[3-5]，但在植物領(lǐng)域卻存有巨大差異的研究結(jié)論，如對植物產(chǎn)生毒性效應(yīng)：造成DNA損傷[6]、抑制種子萌發(fā)與根系生長[7]、降低植物生物量[8]、干擾植物細胞分裂[9]、干擾植物蛋白合成[10]等；也有研究發(fā)現(xiàn)，隨著納米TiO2濃度的增加，植物種子的發(fā)芽率、發(fā)芽率指數(shù)、根長和莖長、鮮重、活力指數(shù)、葉綠素含量顯著增加[11-12]；納米TiO2能有效提高藏紅花的抗氧化活性，能提高藏紅花的營養(yǎng)價值[13]；在多數(shù)情況下，納米TiO2對植物生長發(fā)育的影響多表現(xiàn)出高濃度抑制低濃度促進的現(xiàn)象[14-15]。由于目前納米TiO2對植物的影響機制尚不清楚，有研究發(fā)現(xiàn)：納米TiO2誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過量活性氧，導(dǎo)致植物中的氧化脅迫，誘導(dǎo)其產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和 DNA 損傷[16-17]；納米TiO2通過根到葉，或果實、葉子到根的途徑在植物系統(tǒng)中完成吸收和轉(zhuǎn)運，在這一過程中納米TiO2能夠促進植物對一些營養(yǎng)元素的吸收，進而促進植物的生長發(fā)育[18]，但是如果納米TiO2在植物組織內(nèi)不斷富集，超過植物本身的代謝能力，就會抑制植物的生長[19]。因此，在不同的條件下考察納米TiO2的不同處理方法對植物的生物學(xué)效應(yīng)十分必要。

草地是生態(tài)修復(fù)、石漠化治理模式中不可或缺的組分[20]。黑麥草和高羊茅因適應(yīng)性廣、抗逆性強，為喀斯特石漠化恢復(fù)地區(qū)優(yōu)先選取草本植物[21]。本研究以黑麥草和高羊茅作為受試物種，研究不同濃度納米TiO2對其種子萌發(fā)、根伸長、抗氧化酶活性、葉綠素含量等指標的影響，以期為納米材料在草本植物的遺傳育種中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

納米TiO2粉末由贏創(chuàng)特種化學(xué)(上海)有限公司提供，其型號為AEROXIDE P25，銳鈦礦80%，金紅石20%，平均粒徑21 nm，SPE的表面面積50 m2·g-1，純度大于99.5%。黑麥草與高羊茅種子購于江蘇三春暉種業(yè)。

主要儀器：恒溫水浴鍋；數(shù)控超聲波清洗器；光照培養(yǎng)箱(MGC-300B) ；恒溫振蕩器；紫外可見分光光度計；高速冷凍離心機；根系掃描儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米懸浮液的制備與種子預(yù)處理

分別稱量納米TiO2干粉0.01 g、0.02 g、0.04 g和0.08 g，懸浮于100 mL超純水中。將懸浮液在超聲波清洗儀中以320 W的強度超聲處理30 min后，即得到濃度分別為100 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1和800 mg·L-1的納米TiO2懸浮液，以超純水作空白對照試驗。收集顆粒飽滿，品質(zhì)良好的種子，用10%次氯酸鈉溶液消毒20 min，再用純水沖洗5次，將漂浮的劣質(zhì)種子去除，保存于無菌密封袋中，貼上標簽備用。

1.2.2 種子的萌發(fā)與培養(yǎng)

將處理好的黑麥草種子和高羊茅種子分別浸泡于100 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1和800 mg·L-1濃度的納米TiO2懸浮液中，以超純水(0 mg·L-1TiO2)處理為對照，放入恒溫振蕩器中以170 r·min-1轉(zhuǎn)速震蕩混合，24 h后取出用超純水清洗4次。用5 mL超純水將濾紙浸濕，每兩片濾紙放在1個直徑9 mm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放10粒種子。將培養(yǎng)皿用透氣不透水的薄膜(PM-996 Parafilm M)包裹密封，并置于光照培養(yǎng)箱中催芽，溫度設(shè)為20 ℃，無光照，每個處理3次重復(fù)，連續(xù)2 d沒有新的種子發(fā)芽為實驗結(jié)束。種子萌發(fā)實驗結(jié)束后將幼苗移至霍格蘭營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，生長環(huán)境設(shè)置為：白天溫度25 ℃，光照6 000 lx，時間14 h；夜晚溫度20 ℃，無光照，時間10 h。

1.2.3 指標測定與計算方法

1.2.3.1 種子萌發(fā)指標與根系形態(tài)指標的測定

實驗開始后每24 h觀察1次并記錄種子萌發(fā)數(shù)，以胚根突破種皮2 mm作為種子發(fā)芽的標志，連續(xù)2 d沒有新的種子發(fā)芽為實驗結(jié)束，按照國家標準計算種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)。將幼苗轉(zhuǎn)移至霍格蘭培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)15 d后，測定各濃度納米TiO2溶液處理的所有黑麥草和高羊茅幼苗的根系形態(tài)以及地上、地下部鮮重。

計算公式如下：

(1)

(2)

種子發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)

(3)

式中，M為供試種子粒數(shù)；M1為全部正常發(fā)芽粒數(shù)；M2為達到發(fā)芽高峰期的種子數(shù)；Gt為時間t內(nèi)的發(fā)芽數(shù)；Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

幼苗生長15 d后，將植株幼苗取出，用超純水小心沖洗3次后用濾紙吸干其表面水分，稱其鮮重，保留小數(shù)點后2位。由于單株植物幼苗鮮重過小，為直觀展現(xiàn)鮮重的變化趨勢，黑麥草在各個處理濃度下取30株進行稱量，高羊茅取20株，每種濃度重復(fù)取樣3次。

根長，根表面積，總投影面積，根體積和根尖數(shù)等指標采用STD 4800 SCANNER根系掃描儀對不同濃度納米TiO2溶液處理下植物幼苗的根系進行掃描，采用WinRHIZO TRON MF圖像分析軟件對根系指標數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.2.3.2 幼苗生理指標測定

酶液的制備：取0.1 g幼苗葉片擦洗干凈，加入1 mL的磷酸緩沖液(0.05 moL·L-1，pH 7.0)研磨為勻漿，將勻漿倒入離心管，用PBS沖洗，定容至5 mL，在4 ℃，12 000 r·min-1條件下冷凍離心10 min，上清液即為待測酶液，置于4 ℃冰箱待用。過氧化物酶(POD) 的測定采用愈創(chuàng)木酚法[22]。丙二醛(MDA)的測定采用硫代巴比妥酸法[22]。葉綠素的測定采用丙酮乙醇混合液法[23]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計分析軟件SPSS 19.0 對實驗所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差法(LSD)進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米TiO2對黑麥草和高羊茅種子萌發(fā)的影響

由表1可知：不同濃度的納米TiO2對黑麥草和高羊茅種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)都有不同程度的促進作用；黑麥草和高羊茅的發(fā)芽率雖然都高于對照組，但均沒有顯著性差異；在納米TiO2濃度為200 mg·L-1時黑麥草種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均顯著高于對照組，分別提高了27.2%和44.3%，存在顯著性差異；在納米TiO2濃度為100 mg·L-1時高羊茅種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均顯著高于對照組，分別提高了63.6%和42.9%，存在顯著性差異。

表1 納米TiO2處理下黑麥草和高羊茅種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)Tab.1 The germination rate, germination index and germination energy of L. perenne and F. arundinacea seeds treated by Nano-TiO2

2.2 納米TiO2對種子根系形態(tài)與幼苗生長的影響

將培養(yǎng)于霍格蘭營養(yǎng)液15 d的黑麥草和高羊茅幼苗取出，測定其根系形態(tài)，結(jié)果見表2。由表2可知：當納米TiO2濃度為100 mg·L-1時對黑麥草和高羊茅幼苗的根系生長有一定促進作用；在100 mg·L-1濃度下黑麥草的根長、根表面積、根體積和根尖數(shù)分別高于對照組33.8%、47.8%、33.12%和23.8%，存在顯著性差異，其余濃度處理組均不同程度的抑制了黑麥草根系的生長；在100 mg·L-1濃度下對高羊茅的根尖數(shù)具有顯著促進作用，高于對照組36.9%，對根長、根表面積、根體積的促進作用明顯，但不存在顯著性差異；隨著納米TiO2濃度的增加，高羊茅幼苗的根系生長受到了明顯的抑制作用。

表2 不同濃度的納米TiO2對黑麥草和高羊茅種子根系形態(tài)的影響Tab.2 Effects of different concentrations of Nano-TiO2 on root morphology of L. perenne and F. arundinacea

2.3 納米TiO2對種子幼苗生理生化特征的影響

由表3可知：在各濃度納米TiO2溶液處理下均不同程度的降低了黑麥草幼苗的葉綠素含量和鮮重，在濃度為800 mg·L-1時達到最低值，分別低于對照組23.0%和45.6%，具有顯著性差異；在各濃度納米TiO2溶液處理下，黑麥草POD 活性均高于對照組，且在濃度為800 mg·L-1時達到最大值，比對照極顯著增加217.95%，而MDA含量呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，具有顯著的濃度效應(yīng)，分別在濃度為100 mg·L-1和800 mg·L-1時達到最低值和最高值；各濃度納米TiO2溶液處理的高羊茅幼苗的葉綠素含量都顯著低于對照組，其含量在濃度為400 mg·L-1時達到最低值，低于對照組31.3%，具有顯著性差異；各濃度納米TiO2處理下高羊茅葉片的POD活性和MDA含量均呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，其中在處理濃度為100 mg·L-1時同時達到最低值，分別比對照降低了76.9%和74.6%；在處理濃度為400 mg·L-1時POD活性達到最高值，比對照極顯著增加了124.19%，在處理濃度為800 mg·L-1時MDA含量達到最高值，比對照極顯著增加了1 476.87%。

表3 納米TiO2處理下黑麥草葉片的POD、MDA、葉綠素含量和鮮重Tab.3 POD, MDA, chlorophyll content and fresh weight of L. perenne and F. arundinace a leaves treated with Nano-TiO2

3 討論

本試驗選取了黑麥草和高羊茅為實驗對象，研究了納米TiO2對黑麥草和高羊茅的種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，試驗發(fā)現(xiàn)納米TiO2對黑麥草和高羊茅種子的萌發(fā)具有顯著的促進作用，但是最適濃度有所不同。黑麥草在納米TiO2濃度為200 mg·L-1時對其種子萌發(fā)的促進效果最佳，高羊茅則在納米TiO2濃度為100 mg·L-1時其種子萌發(fā)效果最好。這種促進作用可能是由于納米TiO2生物親和性較高，在低濃度處理下納米TiO2可以穿透植物種皮，對種子萌發(fā)和植物生長有顯著影響[24]。由于成熟種子相對干燥，需要吸收大量的水分才能恢復(fù)細胞代謝和生長，有研究證明納米材料由于小尺寸效應(yīng)而影響了植物內(nèi)部滲透水的能力，創(chuàng)造了通道，從而提高了植物的吸水能力[25]，進而促進種子萌發(fā)。

本研究發(fā)現(xiàn)納米TiO2對黑麥草和高羊茅的根系生長以及鮮重均表現(xiàn)出低濃度促進，高濃度抑制的現(xiàn)象。這可能是納米TiO2的高催化性和表面界面效應(yīng)，使其在低濃度下能夠催化植物根系中的酶活性，有效促進其水分和養(yǎng)分的吸收，使得植物根長、根表面積、總投影面積、根體積和根尖數(shù)有所增加，進而增加了植物的幼苗鮮重。但當納米TiO2濃度過高時則會產(chǎn)生相反的效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，過高濃度的納米材料會干擾植物根冠生長激素分布，破壞根伸長區(qū)微管正常排列，并擾亂根分生區(qū)細胞分裂[26]，從而顯著抑制植物根系的生長。

本試驗發(fā)現(xiàn)，各濃度納米TiO2處理都能夠顯著提高黑麥草幼苗葉片的POD活性。其原因可能是在納米TiO2脅迫下會誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的ROS，隨著處理濃度的增加ROS產(chǎn)生量越大，為清除過量ROS，POD活性也隨著增加，從而提高黑麥草幼苗的抗氧化能力。各濃度納米TiO2處理下高羊茅葉片的POD活性呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，這表明低濃度的納米TiO2對高羊茅抗氧化酶活性具有刺激作用，這與Rico等[27]的研究結(jié)果相似。本試驗中黑麥草和高羊茅葉片MDA含量均呈現(xiàn)出先降低后升高的現(xiàn)象，說明在低濃度納米TiO2處理下抗氧化酶活性確實降低了植物葉片細胞膜的損傷。各濃度納米TiO2處理下黑麥草葉綠素含量均顯著低于對照組，高羊茅僅在處理濃度為100 mg·L-1時葉綠素含量與對照組無顯著性差異，該結(jié)果與施夏明等[28]研究結(jié)果一致，其原因可能是高濃度納米TiO2可能通過誘導(dǎo)產(chǎn)生過量ROS，進而氧化葉綠素，降低植物光合作用。也有研究證明金屬氧化物納米顆粒會被植物吸收并吸附并聚集在葉綠體表面[29]，葉細胞中有大量的納米TiO2團聚體使細胞壁折疊、內(nèi)陷，橢圓葉綠體變圓，類囊體膨脹解體，殘存的基粒和基質(zhì)類囊體更加腫脹、疏松，導(dǎo)致葉綠素含量降低[30]，影響植物的光合作用，從而抑制植物幼苗生長。本研究發(fā)現(xiàn)在納米TiO2處理濃度為100 mg·L-1時黑麥草和高羊茅的葉綠素含量均在一定程度上低于對照，但二者的鮮重并未與對照產(chǎn)生顯著性差異，甚至高羊茅的鮮重高于對照14.67%。這可能是該處理濃度下幼苗的根系生長顯著優(yōu)于對照，有助于吸收營養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)和無機鹽，從而促進植物的生長。Alimohammadi等[31]在番茄對碳納米管的混合反應(yīng)中顯示，當生物量增加時，葉綠素含量下降。

研究初步表明，低濃度的納米TiO2(100 mg·L-1)對黑麥草和高羊茅種子萌發(fā)、根系生長具有顯著促進作用，這可能是低濃度的納米TiO2對草本植物具有較強的親和性，能夠催化植物根系的酶活性。但隨著處理濃度的增加，納米TiO2在植物組織內(nèi)富集，葉綠素含量降低，細胞膜嚴重損傷，黑麥草和高羊茅幼苗的生長及發(fā)育受到顯著抑制作用。