龔小見(jiàn)，趙 超，周 欣*

(1.貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550001；2.貴州師范大學(xué) 貴州省藥物質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550001；3.貴州師范大學(xué) 天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550001)

0 引言

犁頭草為菫菜科植物戟葉堇菜(ViolabetonicidoliaW.W.Sm)長(zhǎng)萼堇菜(ViolainconspicuaBlume Bi)、及心葉堇菜(ViolacordifoliaW.Beck)的新鮮或干燥全草，別名鏵頭草、犁鏵尖、犁嘴草、箭頭草、如意草、玉如意、耳鉤草等，多年生草本植物。具有清熱解毒，散瘀消腫。用于乳癰，喉痛，目赤腫痛，瘡瘍腫毒，刀傷出血[1]。犁頭草為貴州省習(xí)用少數(shù)民族藥材，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003版。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，犁頭草具有較好的體外抑菌[2]和四氯化碳致小鼠急性肝損傷的修復(fù)[3]等作用，對(duì)化膿性關(guān)節(jié)炎[4-5]和慢性骨髓炎[6]有一定的臨床療效。犁頭草中的主要化學(xué)成分為黃酮類化合物[7-10]，黃酮類化合物具有很強(qiáng)的抗氧化作用，是中藥材發(fā)揮藥效的主要化合物類型之一。犁頭草收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003版)中，但在該標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)，不能全面地控制犁頭草藥材的質(zhì)量。本文采用紫外分光光度法[11-17]，建立了犁頭草中總黃酮含量測(cè)定方法，該方法簡(jiǎn)便快速，回收率高，可為黔產(chǎn)犁頭草的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

犁頭草藥材主要采自貴州省內(nèi)不同地區(qū)，表1為犁頭草樣品采集地和采集時(shí)間的信息。藥材經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為犁頭草(戟葉堇菜ViolabetonicidoliaW.W.Sm)。蘆丁(上海伊卡生物技術(shù)有限公司)；甲醇、乙醇、三氯化鋁均為分析純，蒸餾水。

表1 犁頭草樣品信息表Tab.1 Tested material of Viola betonicidolia and their local variety

1.2 儀器

酶標(biāo)儀(Max Plus 384)，美國(guó)Moleaular Devices；AL 204萬(wàn)分之一分析天平和XS 105十萬(wàn)分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(DK-98-II)，天津市泰斯特儀器有限公司；離心機(jī)(TDL-5A)，常州萬(wàn)合儀器制造有限公司；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-300DE)，昆山市超聲儀器有限公司；搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(DFY-200)，溫嶺市林大機(jī)械。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品約5.00 mg于25 mL容量瓶中，加入80%乙醇溶解，定容至刻度即得對(duì)照品儲(chǔ)備液，濃度為0.2 mg/mL。

2.2 樣品溶液的制備

精密稱取犁頭草藥材粉末0.100 0 g(精確到0.000 1 g)，加入20 mL 80%乙醇溶液，精密稱定后水浴回流提取，回流時(shí)間為1.0 h，室溫放冷后補(bǔ)重，將提取液離心(3 500 r/min，5 min)，取上清液，即得供試品溶液。

2.3 測(cè)定方法

實(shí)驗(yàn)采用三氯化鋁顯色法，移取1.0 mL樣品溶液于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL 0.1 mol/L的AlCl3，搖勻放置5 min后，用80%的乙醇定容至10 mL，搖勻放置5 min，每組平行測(cè)定3次。以空白試劑為參比，測(cè)定其在270 nm波長(zhǎng)處吸光度值(A)。

2.4 線性范圍考查

精密量取0.2 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液0.0 mL、0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，以80%乙醇為空白對(duì)照，加入1.0 mL 0.1 mol/L的AlCl3，搖勻放置5 min后，用80%的乙醇定容至10 mL，270 nm處測(cè)定吸光度(A)。以蘆丁對(duì)照品溶液的濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明蘆丁在濃度0.005～0.04 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程A=4.290 5C-0.000 4(R2=0.999 9)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of rutin reference

2.5 精密度考查

取蘆丁對(duì)照品溶液，按“2.3項(xiàng)測(cè)定方法”進(jìn)行處理，測(cè)定270 nm吸光度值A(chǔ)，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果RSD值為0.92%(n=6)，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取6份犁頭草藥材0.100 0 g，置于具塞錐形瓶中，按“2.2 樣品溶液的制備”方法制備供試液，以“2.3項(xiàng)測(cè)定方法”進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果RSD值為0.86%(n=6)，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取犁頭草藥材0.100 0 g，按“2.2 樣品溶液的制備”方法制備供試液，以“2.3項(xiàng)測(cè)定方法”進(jìn)行測(cè)定。分別后于0.0 h、0.25 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h進(jìn)行吸光度測(cè)定，結(jié)果樣品溶液吸光度的RSD為0.75%(n=6)，說(shuō)明樣品溶液顯色后在2 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取9份已知總黃酮含量的同一批犁頭草藥材0.050 0 g，分別精密加入適量蘆丁對(duì)照品溶液，按“2.3項(xiàng)測(cè)定方法”進(jìn)行測(cè)定，以空白試劑為參比，于270 nm處測(cè)定吸光度(A)并計(jì)算回收率。結(jié)果如表2所示，平均加樣回收率為97.60%，RSD值為0.03%(n=3)，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Add recovery experiment

2.9 樣品含量測(cè)定

精密稱取各批次犁頭草藥材0.100 0 g，置具塞錐形瓶中，按“2.2 樣品溶液的制備”方法制備供試液，以“2.3項(xiàng)測(cè)定方法”進(jìn)行測(cè)定，在270 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算含量。結(jié)果如表3所示，貴州省內(nèi)不同產(chǎn)地犁頭草藥材總黃酮含量在2.10%～4.04%之間，說(shuō)明黔產(chǎn)犁頭草藥材質(zhì)量穩(wěn)定均一。

表3 黔產(chǎn)犁頭草藥材總黃酮含量Tab.3 Total flavones of Viola betonicidolia from different producing areas

3 結(jié)果與討論

3.1 提取方法的考察

精密稱取犁頭草藥材0.100 0 g，置于具塞錐形瓶中，加入20 mL 80%乙醇，精密稱重后，分別用超聲提取(300 W，40 KHz)、回流提取和熱浸法，提取時(shí)間均為30 min，室溫放冷后補(bǔ)重，將提取液離心，移取上清液1.0 mL按“2.3項(xiàng)測(cè)定方法”測(cè)吸光度值。結(jié)果顯示，回流提取法提取的總黃酮含量最高，故選用回流提取法。

圖2 提取方法的考察Fig.2 Investigation of extraction methods

3.2 提取溶劑的考察

分別以水，甲醇，乙醇溶液為提取溶劑，回流提取30 min，按“2.3項(xiàng)測(cè)定方法”測(cè)吸光度值。結(jié)果顯示，乙醇提取液的總黃酮含量最高，故選用乙醇為提取溶劑。

圖3 提取溶劑的考察Fig.3 Investigation of extraction solvent

3.3 提取溶劑濃度的考察

分別以40%，60%，70%，80%，100%的乙醇為提取溶劑，回流提取30 min，按“2.3項(xiàng)測(cè)定方法”測(cè)定吸光度值。結(jié)果顯示，乙醇濃度為70%時(shí)提取效果最好，故選用70%乙醇做提取溶劑。

圖4 提取溶劑濃度的考察Fig.4 Investigation of extraction solvent concentration

3.4 溶劑用量的考察

精密稱取犁頭草藥材4份，每份0.100 0 g，分別加入10 mL、20 mL、30 mL、40 mL 70%乙醇溶液，回流提取，按“2.3項(xiàng)測(cè)定方法”測(cè)定吸光度值。結(jié)果顯示，溶劑用量為20 mL后，提取的總黃酮含量逐漸趨平，因此選擇提取溶劑用量為20 mL。

圖5 溶劑用量的考察Fig.5 Determination of solvent dosage

3.5 提取時(shí)間的考察

精密稱取犁頭草藥材5份，每份0.100 0 g，加入20 mL 80%乙醇，分別回流提取0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h，按“2.3項(xiàng)測(cè)定方法”，測(cè)定吸光度值。結(jié)果顯示，1.5 h時(shí)提取效果最好，故選擇提取時(shí)間為1.5 h。

圖6 提取時(shí)間的考察Fig.6 Investigation of extraction time

3.6 犁頭草總黃酮提取方法的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

以總黃酮含量為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度、溶劑用量和提取時(shí)間作為考察因素(見(jiàn)表4)，設(shè)計(jì)L9(33)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

表4 正交試驗(yàn)考察Tab.4 Orthogonal test

由正交試驗(yàn)結(jié)果(表5)與極差分析(表6)可知：黔產(chǎn)犁頭草總黃酮提取方法中，各因素對(duì)黃酮得率的影響主次順序?yàn)锽(溶劑用量)>A(乙醇體積分?jǐn)?shù))>C(提取時(shí)間)；有直觀分析得出最佳提取工藝條件為A3B2C1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，溶劑用量為20 mL，提取時(shí)間為1.0 h。

表5 黔產(chǎn)犁頭草總黃酮提取方法L9 (33) 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Rthogonal test results of L9(33) for extraction method of total flavone of Viola betonicidolia from Guizhou

表6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方差分析Tab.6 Analysis of variance for orthogonal experimental design

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了黔產(chǎn)犁頭草中總黃酮的含量測(cè)定方法，該方法精密度和重復(fù)性好、回收率高，且穩(wěn)定可靠，操作簡(jiǎn)單實(shí)用，可用于黔產(chǎn)犁頭草藥材總黃酮含量測(cè)定。應(yīng)用該方法對(duì)采自貴州10個(gè)不同產(chǎn)地的犁頭草藥材進(jìn)行了總黃酮含量測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10個(gè)不同產(chǎn)地的犁頭草藥材中總黃酮含量均在在2.10%～4.04%之間，說(shuō)明黔產(chǎn)犁頭草藥材在總黃酮含量方面質(zhì)量穩(wěn)定均一。