張馨元，徐巖，王棟*，陳雙*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

白酒是我國(guó)民族特色蒸餾酒，在2000多年的發(fā)展歷史中，白酒產(chǎn)品的酒精度經(jīng)歷了從低度走向高度，又從高度走向低度的發(fā)展歷程[1]。隨著消費(fèi)者消費(fèi)趨勢(shì)的變化和白酒國(guó)際化的發(fā)展，白酒低度化成為當(dāng)前白酒發(fā)展的重要趨勢(shì)[2]。1970年代，白酒冷凍除濁技術(shù)的發(fā)明、五糧液通過(guò)優(yōu)選法生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)低度白酒獲得成功以及低度白酒首獲國(guó)家優(yōu)質(zhì)稱號(hào)，標(biāo)志著白酒低度化的發(fā)展拉開(kāi)了序幕[3]。1980-1990年，50°以下的低度白酒或降度白酒占到總產(chǎn)量的50%以上，2000年至今已經(jīng)占到了90%以上[4]。但優(yōu)質(zhì)低度白酒的生產(chǎn)不是簡(jiǎn)單的加水降度，為了既保持酒體不渾濁，又保障酒的風(fēng)味品質(zhì)不降低，相較于高度白酒，低度白酒的工藝更復(fù)雜，工藝技術(shù)要求更高[3,5]。這也使得優(yōu)質(zhì)低度白酒的生產(chǎn)具有較大的難度，成為限制白酒低度發(fā)展的瓶頸之一。

白酒是經(jīng)過(guò)糧食固態(tài)發(fā)酵、固態(tài)蒸餾得到的蒸餾酒，白酒特有發(fā)酵工藝過(guò)程形成了復(fù)雜的風(fēng)味化學(xué)組分，通過(guò)獨(dú)特的固態(tài)甑桶蒸餾，使得酒醅中大量揮發(fā)性和半揮發(fā)性組分進(jìn)入白酒，這些組分共同構(gòu)成了白酒的整體風(fēng)味特征[6]。在低度白酒生產(chǎn)過(guò)程中加漿降度是生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]。隨著酒精度的降低，酒中醇水溶劑比例發(fā)生顯著變化，造成白酒體系從以乙醇為溶劑主體轉(zhuǎn)變?yōu)樗疄槿軇┲黧w，這也顯著影響了其中風(fēng)味組分的含量和溶解度[5,8]。低度白酒生產(chǎn)過(guò)程中普遍存在加漿渾濁、沉淀等物理問(wèn)題和“味淡”、“欠豐滿”和“貨架期變化”等風(fēng)味化學(xué)問(wèn)題。白酒行業(yè)針對(duì)這些問(wèn)題開(kāi)展了廣泛的研究攻關(guān)。通過(guò)冷凍沉淀、介質(zhì)過(guò)濾、工藝用水純化等技術(shù)手段，白酒降度過(guò)程中出現(xiàn)的渾濁、沉淀等問(wèn)題已經(jīng)得到基本解決[9-11]。但白酒降度過(guò)程中低度白酒風(fēng)味品質(zhì)的保持和提升卻始終存在較大的技術(shù)難題[8]?？蒲泄ぷ髡吆托袠I(yè)技術(shù)人員從釀造工藝角度對(duì)低度白酒品質(zhì)提升進(jìn)行了大量研究，明晰了生產(chǎn)基酒、加漿用水等工藝環(huán)節(jié)對(duì)低度白酒生產(chǎn)的影響[12]，同時(shí)對(duì)低度白酒貯存貨架期穩(wěn)定性問(wèn)題也進(jìn)行了大量研究，基本明晰了低度白酒貯存過(guò)程中色譜骨架成分的變化規(guī)律[8]。但這些研究大多基于對(duì)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)的實(shí)踐總結(jié)，尚未實(shí)現(xiàn)以風(fēng)味化學(xué)和消費(fèi)者感官導(dǎo)向?yàn)榛A(chǔ)科學(xué)設(shè)計(jì)調(diào)控低度白酒的風(fēng)味品質(zhì)，其根本原因還是低度白酒的生產(chǎn)缺乏科學(xué)風(fēng)味化學(xué)理論支撐。

為了探究低度白酒區(qū)別于高度白酒的風(fēng)味化學(xué)特征，本論文采用現(xiàn)代風(fēng)味化學(xué)的分析方法，對(duì)比分析了主流濃香型白酒廠同系列不同酒精度(低度/高度)白酒樣品中揮發(fā)性組分含量特征。試圖通過(guò)這些優(yōu)質(zhì)低度白酒揮發(fā)性組分種類含量特征的解析，探索影響低度白酒品質(zhì)的風(fēng)味化學(xué)因素，為低度白酒品質(zhì)的提升提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

從市場(chǎng)選購(gòu)了主流濃香型白酒企業(yè)生產(chǎn)的價(jià)位在100～500元不等的同系列的高濃度和低濃度濃香型成品酒7組共14款酒樣：JL(38%/52%vol)，SJ(38%/52%vol)，JN(38%/52%vol)，TZ(42%/52%vol)，XT(42%/52%vol)，YJ(40.6%/45%vol)，LW(39%/52%vol)，以上樣品均購(gòu)自各品牌官方旗艦店。

1.1.2 試劑

C7-C30直鏈正構(gòu)烷烴和乙醇(色譜級(jí))，Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司；NaCl(化學(xué)純)，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水由Mili-Q(Milli-Q系統(tǒng)，Millipore，Bedford，MA，USA)純水儀制備。

標(biāo)準(zhǔn)品：定量的83種化合物標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)，Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司、百靈威科技有限公司(上海)和阿法埃莎(中國(guó)天津)化學(xué)有限公司；內(nèi)標(biāo)化合物2,2-二甲基丙酸(98%)，2-辛醇(99%)，β-苯乙酸乙酯-d3(99%)，正己醇-d13(99%)和2-甲氧基-d3-苯酚(≥98%)，Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

GC 7890-MSD 5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司； SPME Arrow PAL RSI自動(dòng)進(jìn)樣器，瑞士CTC Analytics AG公司；SPME Arrow三相萃取頭(DVB/Carbon WR/PDMS)，瑞士CTC Analytics AG公司；DB-FFAP色譜柱，美國(guó)Agilent公司；7890B氣相色譜-氫離子火焰檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

1.2.1 頂空固相微萃取箭頭結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法按照本實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化建立的頂空固相萃取箭頭結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜(headspace solid phase microextraction arrow and gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME Arrow-GC-MS)進(jìn)行[13]。用煮沸的超純水將上述濃香型成品酒樣品分別稀釋至10%vol和1%vol，在20 mL頂空瓶中加入1.5 g NaCl和5 mL稀釋后的白酒樣品，添加40 μL混合內(nèi)標(biāo)(終質(zhì)量濃度：2,2-二甲基丙酸，1197 μg/L；2-辛醇，294 μg/L；β-苯乙酸乙酯-d3，146 μg/L；正己醇-d13，323 μg/L；2-甲氧基-d3-苯酚，307 μg/L)。將樣品在45 ℃下平衡5 min，將SPME Arrow纖維插入并吸附45 min，轉(zhuǎn)速為250 r/min。萃取完成后在250 ℃的GC進(jìn)樣口，以不分流模式解吸附5 min。相同條件下每個(gè)樣品各分析3次。

色譜條件：樣品分析色譜柱為DB-FFAP(60 m×0.25 mm,0.25 μm,Agilent,CA,USA)毛細(xì)管柱。以恒定流速1 mL/min的高純度氦氣(≥99.999%)作為載氣。柱溫箱升溫程序：起始溫度40 ℃保持2 min，以4 ℃/min升至150 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min升至230 ℃并保持5 min。

質(zhì)譜條件：離子源電壓為70 eV，溫度為230 ℃，傳輸線溫度為250 ℃，掃描質(zhì)量范圍為35～350 aum，其中2,3-丁二酮、3-甲硫基丙醛、反-2-順-6-壬二烯醛和β-大馬酮采用SIM模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，選擇的掃描離子分別為86、104、69和121。

化合物的定性與定量：在與樣品相同的色譜質(zhì)譜條件下，根據(jù)揮發(fā)性化合物的質(zhì)譜(MS)和保留指數(shù)(RI)與純標(biāo)準(zhǔn)品(STD)進(jìn)行比較鑒定。使用C7-C30的正構(gòu)烷烴混合物計(jì)算保留指數(shù)(RIcal)。除了與純標(biāo)準(zhǔn)品的保留指數(shù)(RI)進(jìn)行比較外，還將RIcal與文獻(xiàn)中報(bào)道的保留指數(shù)(RIlit)進(jìn)行比較,確定目標(biāo)化合物。采用選擇離子模式(selective ion monitoring,SIM)計(jì)算每個(gè)目標(biāo)化合物峰面積，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算化合物濃度。

1.2.2 GC-FID實(shí)驗(yàn)方法

選用GC-FID定量含量高，在GC-MS中嚴(yán)重過(guò)載的香氣化合物。將上述濃香型成品酒樣直接加入內(nèi)標(biāo)乙酸正戊酯(終質(zhì)量濃度：187.40 mg/L)，搖勻后直接進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μ L，分流比37∶1。樣品通過(guò)DB-Wax(30 m×0.32 mm,0.25 μm,Agilent,CA,USA)色譜柱分離。色譜分離條件：進(jìn)樣口250 ℃；以高純氮?dú)庾鳛檩d氣，流速為1 mL/min；檢測(cè)器溫度250 ℃。根據(jù)以下升溫程序進(jìn)行分離：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至150 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃并保持5 min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線確立：在體積分?jǐn)?shù)為52%和38%的酒精水溶液中加入已知的待測(cè)化合物標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行2倍梯度稀釋，共8個(gè)梯度。每個(gè)梯度加入內(nèi)標(biāo)乙酸正戊酯(終質(zhì)量濃度：187.40 mg/L)，其余均按照與酒樣相同條件處理。以目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)化合物質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo)，目標(biāo)化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)化合物峰面積之比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

對(duì)于同系列高低度濃香型白酒中揮發(fā)性組分含量差異的分析，均建立在對(duì)樣品進(jìn)行酒精度折算后的直接定量結(jié)果，例如JL系列中的高度酒(乙醇體積分?jǐn)?shù)為52%，52°)中乙酸乙酯的含量為1.08 g/L，將其折算至同系列中低度白酒(38°)同一酒度即1.08×(38/52)=0.79 g/L并與同系列低度白酒中檢測(cè)到同一化合物含量進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

本研究為了全面準(zhǔn)確提取白酒中盡可能多的揮發(fā)性化合物，采用HS-SPME Arrow-GC-MS聯(lián)合GC-FID分析技術(shù)對(duì)不同品牌同系列的高低度濃香型白酒中揮發(fā)性組分進(jìn)行分析，在來(lái)自5個(gè)品牌共7個(gè)系列的高低度濃香型成品酒中鑒定出83種揮發(fā)性化合物，包括酯類34種、醇類13種、酸類8種、醛酮類14種、呋喃類3種、硫化物2種、酚類5種和萜烯類4種。

基于對(duì)樣品中揮發(fā)性風(fēng)味組分的定量結(jié)果，進(jìn)一步比較揮發(fā)性物質(zhì)在高度/低度白酒中含量差異，結(jié)果顯示，同系列高度酒中含量高于低度白酒的有32個(gè)化合物，包括酯類20種、醇類3種、酸類2種、醛酮類4種和酚類3種；低度白酒中含量高的有32個(gè)化合物，包括酯類9種、醇類6種、酸類5種、醛酮類8種、呋喃類2種、含硫化合物1種和萜烯類1種；其他無(wú)明顯規(guī)律的有19個(gè)化合物，結(jié)果如圖1所示。其中含量較高的組分(平均含量>50 mg/L)比值如表1所示。

圖1 同系列高低度白酒中揮發(fā)性化合物含量差異分類Fig.1 Classification of contents of volatile compounds inhigh-alcohol and low-alcohol strong aroma type Baijiufrom the same series of different brands

表1羅列了定量結(jié)果中在本次檢測(cè)的7個(gè)系列中含量較高的11種揮發(fā)性化合物在同系列高低度白酒中的比值，包括酯類5種、醇類2種和酸類4種，7個(gè)系列中有超過(guò)4個(gè)系列的比值處于同一區(qū)間范圍的則認(rèn)定該化合物在高低度白酒中揮發(fā)性化合物含量差異分析中具有統(tǒng)一規(guī)律，同系列高度白酒中含量高于低度白酒(比值>1)的有4個(gè)化合物，同系列低度白酒中含量高(比值<1)的有6個(gè)化合物。由表1可見(jiàn)，具有統(tǒng)一規(guī)律且在高度白酒中含量更高的化合物有乙酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯；此外，丁酸乙酯和己酸乙酯在7個(gè)系列中有4組的比值均約等于1，即其在度數(shù)折算后同系列高低度酒中含量差異不明顯，但在直接定量結(jié)果中同系列高低度酒中含量更高，這與前人研究結(jié)論高度酒中高含量揮發(fā)性組分含量較高一致[14-15]。而具有統(tǒng)一規(guī)律但在低度白酒中含量更高的化合物有2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、乙酸、丙酸、丁酸和己酸，其中3-甲基丁醇在低度白酒中較高的定量結(jié)果符合前人研究結(jié)果[16]。此外，低度酒中4種酸的含量也較高，可能是由于低度白酒貯存過(guò)程中發(fā)生了水解反應(yīng)即酯類物質(zhì)水解，酸類物質(zhì)增加導(dǎo)致的[14,17]，其中貯藏超過(guò)3個(gè)月即可引起總酯降低超過(guò)10%，同時(shí)總酸增加超過(guò)10%[18]，也有可能是對(duì)低度白酒勾調(diào)時(shí)選用了總酸含量較高的酒尾調(diào)味酒以增加酒體厚重感所致[12]。以上高含量酯類揮發(fā)性組分進(jìn)行酒精度折算后多差異不明顯或在高度白酒中仍含量更高，可見(jiàn)勾調(diào)帶來(lái)的風(fēng)味修飾并不是針對(duì)這些高含量的香氣組分的修飾。以下將重點(diǎn)分析討論低度白酒中含量高的微量成分的差異規(guī)律。

表1 同一系列高低度濃香型白酒高含量揮發(fā)性化合物含量差異比值Table 1 Content ratio of main volatile compoundsin high-alcohol and low-alcohol strong aroma type Baijiufrom the same series

除了上文所述的2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、乙酸、丙酸、丁酸、己酸這6個(gè)高含量揮發(fā)性組分在同系列低度白酒中更高外，本實(shí)驗(yàn)中還有26種微量揮發(fā)性組分在同系列低度白酒中含量更高，包括酯類9種、醇類4種、酸類1種、醛酮類8種、呋喃類2種、含硫化合物1種和萜烯類化合物1種，具體定量結(jié)果比值結(jié)果如表2所示。其中同系列低度白酒中含量略高于(0.5<比值<1)高度白酒中的揮發(fā)性化合物有戊酸乙酯(平均21.45 mg/L)、2-壬酮(平均5.02 mg/L)、壬醛(平均1.29 mg/L)、1-壬醇(平均316.71 μg/L)、2-辛酮(平均523.87 μg/L)、反-2-順-6-壬二烯醛(平均42.89 μg/L)和3-甲硫基丙醛(平均218.20 μg/L)。同系列低度白酒中含量明顯高于(比值<0.5)高度白酒中的揮發(fā)性化合物有2,3-丁二酮(平均118.69 mg/L)、糠醛(平均71.94 mg/L)、己酸丙酯(平均63.25 mg/L)、2-戊酮(平均44.14 mg/L)、戊酸(平均32.96 mg/L)、乙酸異戊酯(平均16.77 mg/L)、1-辛醇(平均4.62 mg/L)、3-辛醇(平均2.85 mg/L)、3-甲基丁酸乙酯(平均2.56 mg/L)、丁酸異戊酯(平均2.47 mg/L)、苯乙酮(平均1.51 mg/L)、2-甲基丁酸乙酯(平均958.79 μg/L)和β-大馬酮(平均22.67 μg/L)。上述20種白酒中重要的“量微香大”化合物有可能是勾調(diào)修飾改變的化合物。

表2 同一系列濃香型白酒中高度白酒樣含量低于低度白酒樣的揮發(fā)性風(fēng)味化合物Table 2 Content ratio of other volatile compounds in high-alcohol and low-alcohol strong aroma type Baijiu fromthe same series

為了進(jìn)一步研究化合物的風(fēng)味貢獻(xiàn)，我們采用國(guó)際上常用的香氣活力值(odor activity value,OAV)來(lái)衡量化合物的香氣貢獻(xiàn)，即某一化合物的質(zhì)量濃度與該化合物的閾值的比值。OAV越大說(shuō)明該化合物對(duì)該體系風(fēng)味的貢獻(xiàn)越大，反之貢獻(xiàn)越小[19]。對(duì)表2中7個(gè)系列濃香型白酒樣品中同系列低度白酒中含量更高的揮發(fā)性化合物按照相近體系或酒精度中的閾值進(jìn)行香氣貢獻(xiàn)判定，除含量較高的化合物外,有香氣貢獻(xiàn)(OAV>1)的微量化合物的OAV如表3所示。

表3 部分優(yōu)質(zhì)低度濃香型白酒中微量風(fēng)味化合物OAVsTable 3 OAVs of flavor compounds at trace level in some low-alcohol strong aroma type Baijiu

由表3可見(jiàn)，同系列低度白酒中含量更高的微量化合物平均OAV>1 000的有：2,3-丁二酮(2 254～283 465)和含量在497.07 μg/L～1.97 mg/L的2-甲基丁酸乙酯(32～3 246)，2,3-丁二酮呈現(xiàn)奶油味[24]，而2-甲基丁酸乙酯主要呈現(xiàn)果香[24]。OAV值在100～1 000的微量化合物有：戊酸乙酯(502～1 436)、3-甲基丁酸乙酯(146～742)、乙酸異戊酯(12～432)和含量在7.2～40.51 μg/L的β-大馬酮(60～338)，戊酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯和乙酸異戊酯作為濃香型白酒中重要的香氣組分主要呈果香[25]，β-大馬酮?jiǎng)t具有玫瑰和蜂蜜的香氣[26]。OAV值在10～100的香氣化合物有：戊酸(38～97)、含量在33.81～99.2 μg/L的反-2-順-6-壬二烯醛(53～155)、含量在57.36～422.88 μg/L 的3-甲硫基丙醛(8～60)、己酸丙酯(1～40)和含量在582.37 μg/L～2.56 mg/L的壬醛(5～21)，此外呈黃瓜味的反-2-順-6-壬二烯醛是首次在濃香型白酒中檢出[23]，3-甲硫基丙醛則呈煮土豆味[24],己酸丙酯主要呈現(xiàn)花果香[25]，而壬醛呈現(xiàn)綠色即清新的香氣[23]，它們中尤其是反-2-順-6-壬二烯醛和3-甲硫基丙醛對(duì)醬香型白酒的香氣有重要貢獻(xiàn)[23]。一般香氣化合物(平均OAV為1～10)有：2-壬酮(4～17)、1-辛醇(1～19)、糠醛(1～8)、丁酸異戊酯(1～6)、含量在218.42～714.89 μg/的1-壬醇(2～6)和含量在452.64～818.3 μg/L的2-辛酮(2～4)，其中2-壬酮呈現(xiàn)綠色的香氣[23]，1-辛醇呈現(xiàn)蘑菇和泥腥味[27]，糠醛主要呈現(xiàn)堅(jiān)果和甜香[3]，丁酸異戊酯主要呈現(xiàn)花果香[25]，而1-壬醇也呈現(xiàn)綠色即清新的香氣[23]，此外2-辛酮呈現(xiàn)脂肪味[24]，這些化合物都對(duì)濃香型白酒的整體香氣具有一定貢獻(xiàn)。本文中目標(biāo)化合物香氣貢獻(xiàn)的判定多基于53%vol乙醇水模擬溶液測(cè)得的閾值，考慮到隨著酒精度的下降香氣化合物的閾值也會(huì)降低的影響[28]，其在低度白酒中的香氣貢獻(xiàn)會(huì)更顯著。同系列中含量低于1 mg/L同時(shí)低度白酒中含量高于高度白酒的香氣活性化合物有：2-甲基丁酸乙酯、1-壬醇、2-辛酮、壬醛、反-2-順-6-壬二烯醛、3-甲硫基丙醛和β-大馬酮，其中酯類和醇類在釀造前期產(chǎn)生[29]，而β-大馬酮?jiǎng)t可以通過(guò)選擇合適的發(fā)酵菌株獲得[30]。

3 結(jié)論

本研究采用SPME Arrow-GC-MS以及GC-FID技術(shù)分析比較了來(lái)自不同品牌的7組同系列優(yōu)質(zhì)低度(乙醇體積分?jǐn)?shù)低于42%)和高度(乙醇體積分?jǐn)?shù)為52%)濃香型白酒揮發(fā)性風(fēng)味組分差異特征。比較分析結(jié)果顯示，在定量分析的83種揮發(fā)性風(fēng)味中，同系列酒樣中高度酒含量高于低度酒含量的揮發(fā)性風(fēng)味組分有32種，其中大多是白酒的骨架成分；同系列酒樣中低度白酒含量高于高度白酒的揮發(fā)性風(fēng)味組分有32種，主要包括有機(jī)酸類風(fēng)味化合物以及白酒中含量較低同時(shí)風(fēng)味閾值也較低的“量微香大”風(fēng)味化合物。不同品牌同系列的低度濃香型白酒中絕大多數(shù)酸類和部分濃香型白酒中“量微香大”揮發(fā)性化合物的含量明顯高于同系列高度酒，這些化合物同時(shí)對(duì)構(gòu)成濃香型白酒獨(dú)特的香氣特征具有重要貢獻(xiàn)。這些微量香氣化合物具體是如何影響低度白酒品質(zhì)的機(jī)理，尚需進(jìn)一步研究。