蔣永超，孫曉靖，陳玉嵐△，張俊仕，珠勒皮亞司馬義，徐新娟，張向陽(yáng)

高血壓可造成心、腦、腎、血管等靶器官損害，其中心臟靶器官損害以左心室肥厚（left ventricular hypertrophy，LVH）最為常見(jiàn)。Framingham 心血管流行病學(xué)研究表明，LVH 是可獨(dú)立預(yù)測(cè)心血管發(fā)病和死亡風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)［1］。研究證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)傳遞途徑是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大發(fā)生、發(fā)展最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一［2］。瞬時(shí)受體電位通道C 亞族（transient receptor potential-canonical channel，TRPC）是位于細(xì)胞膜上的一類重要陽(yáng)離子通道，以四聚體形式構(gòu)成Ca2+內(nèi)流通道，TRPC3是TRPC家族中具有代表性且非常重要的一個(gè)亞群，是TRPC家族中的核心成員，在高血壓心肌肥厚中起關(guān)鍵性作用［3］。目前有關(guān)高血壓人群TRPC3基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與其LVH的相關(guān)性研究報(bào)道甚少。本研究以原發(fā)性高血壓患者為研究對(duì)象，探討TRPC3基因Rs2292232、Rs4995894、Rs4292355這 3 個(gè)位點(diǎn) SNP 與 LVH 的關(guān)系，以期為高血壓心臟靶器官損害的早期干預(yù)研究提供新的思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年3月—2017年12月于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院高血壓科住院并確診為原發(fā)性高血壓的患者305例，男205例，女100例，平均年齡（45.98±10.37）歲。根據(jù)左心室質(zhì)量指數(shù)（left ventricular mass index，LVMI）將患者分為單純高血壓組224 例（對(duì)照組，LVMI 男＜115 g/m2、女＜95 g/m2）和高血壓合并 LVH 組 81 例（LVH 組，LVMI 男≥115 g/m2、女≥95 g/m2）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）原發(fā)性高血壓診斷符合《中國(guó)高血壓防治指南2018 年修訂版》。（2）年齡18～65歲。（3）均為漢族，且患者之間無(wú)一級(jí)、二級(jí)血緣關(guān)系。（4）患者知情同意本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）明確診斷為繼發(fā)性高血壓者。（2）伴心臟瓣膜病、先天性心臟病、心肌病、嚴(yán)重心律失常等對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和功能有影響的心臟疾病者。（3）糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)或減退等內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者。（4）嚴(yán)重肝腎功能損害、慢性消耗性疾病和惡性腫瘤者。（5）血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑或者血管緊張素受體Ⅱ拮抗劑服用半年以上者。

1.2 方法

1.2.1 超聲心動(dòng)圖測(cè)定 采用Philips iE33 彩色多普勒超聲診斷儀進(jìn)行檢測(cè)，探頭頻率為5 MHz。由5 年以上心臟超聲工作經(jīng)驗(yàn)的技師完成。所有指標(biāo)均連續(xù)檢測(cè)3個(gè)心動(dòng)周期取平均值，包括左心室舒張末內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）、左心室收縮末內(nèi)徑（left ventricular endsystolic dimension，LVESD）、室間隔厚度（interventricular septal thickness，IVST）及 左 室 后 壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWT）等。按Devereux 校正公式計(jì)算左心室質(zhì)量（LVM），LVM（g）=0.8×1.04×［（IVST+LVPWT+LVEDD）3-LVEDD3］+0.6，體表面積計(jì)算采用Stevenson 公式，即體表面積（m2）=0.006 1×身高（cm）+0.012 8×體質(zhì)量（kg）-0.152 9，LVMI（g/m2）=LVM/體表面積。

1.2.2 DNA 提取 患者入院后次日清晨空腹取外周靜脈血5 mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中密封，-70 ℃保存。統(tǒng)一采用TIANamp Blood DNA Kit 血液基因組試劑盒（中國(guó)天根生化科技有限公司），按照說(shuō)明書(shū)步驟提取基因組DNA，濃度＞0.02 g/L，光密度（OD）260/OD280比值1.8～2.0。

1.2.3TRPC3基因的SNPs 檢測(cè) 采用Sequenom MassARRAY?SNP 檢測(cè)結(jié)合多重PCR 技術(shù)、MassARRAYiPLEX 單堿基延伸技術(shù)及基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析技術(shù)（博奧生物集團(tuán)有限公司暨生物芯片北京國(guó)家工程研究中 心）對(duì)TRPC3基 因 SNP 位 點(diǎn)Rs2292232、Rs4995894、Rs4292355進(jìn)行基因分型檢測(cè)。各位點(diǎn)引物序列見(jiàn)表1。根據(jù)Hapmap、NCBI-SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)選擇位點(diǎn)，按照最小等位基因頻率（Miner Allele Frequency，MAF）＞0.05 且R2＞0.8 篩選出上述 3 個(gè) SNP 位點(diǎn)。PCR 反應(yīng)體系:10×PCR 反應(yīng)緩沖液 0.5 μL、25 mmol/L MgCl20.4 μL、25 mmol/L dNTP 0.1 μL，二次蒸餾純凈水1.9 μL，500 nmol/L 引物混合物1.0 μL，5 U/μL Hot-StarTaq 0.1 μL，DNA模板1 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 4 min；94 ℃20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min，4 ℃保持。加入 SAP Mix 反應(yīng)液 2.0 μL，SAP 處理?xiàng)l件：37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min，4 ℃維持。加入單堿基延伸反應(yīng)液2 μL，單堿基延伸反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，（52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s）×5，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min，4 ℃維持，運(yùn)用 MALDI-TOF 質(zhì)譜儀分析樹(shù)脂純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)結(jié)果采用TYPER4.0軟件（sequenom）分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與處理。Hardy-Weinberg 平衡定律驗(yàn)證樣本的群體代表性。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)M（P25，P75）表示，2 組間比較采用Mann-WhitenyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料及組間基因型頻率分布比較采用χ2檢驗(yàn)，Logistic回歸模型分析基因及相關(guān)因素與LVH 的關(guān)系，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab.1 Primer sequence of PCR表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較 2 組年齡、吸煙史、飲酒史、家族史、尿素（UREA）、肌酐（CREA）、空腹血糖（FBG）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、24 h平均舒張壓（24 h DBP）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），LVH 組較對(duì)照組男性比例降低，24 h 平均收縮壓（24 h SBP）、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）升高（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.2 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)及等位基因分布頻率比較 LVH 組、對(duì)照組TRPC3基因 3 個(gè) SNP位點(diǎn)等位基因頻率均處于Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)（P＞0.05），樣本具有群體代表性，見(jiàn)表3。2 組TRPC3基因 SNP 位點(diǎn)Rs4995894、Rs4292355基因型和等位基因頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Rs2292232位點(diǎn)基因型和等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中LVH 組較對(duì)照組TT 基因型頻率明顯升高（28.40%vs.15.63%，P＜0.05）。

Tab.2 Comparison of general clinical data between LVH group and control group表2 LVH組與對(duì)照組一般臨床資料比較

Tab.3 Comparison of H-W genetic balance test and allele frequency between the two groups表3 LVH組與對(duì)照組Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)和等位基因頻率比較

2.3 Logistic 回歸分析 以是否為L(zhǎng)VH（否=0，是=1）為因變量，性別（女=0，男=1）、BMI、24 h SBP、Rs2292232基因型（GG+GT=0，TT=1）為自變量，進(jìn)行Logistic 回歸分析顯示，女性、較高24 h SBP、TRPC3基因SNPRs2292232TT基因型為原發(fā)性高血壓患者發(fā)生LVH的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表4。

3 討論

高血壓合并LVH 是機(jī)體對(duì)血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷長(zhǎng)期增加的一種適應(yīng)性反應(yīng)，高血壓和LVH均是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［4-5］。臨床上，有些高血壓患者雖然持久有效控制了血壓，但心肌肥厚繼續(xù)存在，部分高血壓患者甚至在臨床診斷高血壓前就已經(jīng)出現(xiàn)LVH。高血壓伴L(zhǎng)VH 的加權(quán)危險(xiǎn)會(huì)加劇并促進(jìn)心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展［6］，而逆轉(zhuǎn)LVH 可顯著降低心血管病死亡、心肌梗死、腦卒中和心力衰竭等發(fā)生的概率［7］。因此，高血壓伴L(zhǎng)VH 是一種需早期關(guān)注的靶器官損害。近年大量研究表明，心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高是引起心肌細(xì)胞肥大的最根本原因，是引起初級(jí)和次級(jí)應(yīng)答基因變化的始動(dòng)因素和載體，而且也是心肌肥厚發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵［8］。TRPC通道是一種主要滲透Ca2+的非電壓門控陽(yáng)離子通道［9］，在心臟分布廣泛，對(duì)心肌肥厚的發(fā)生起重要作用［10］；其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控鈣調(diào)節(jié)磷酸酶-活化 T 細(xì)胞因子（calcineurin-nuclear factor of activated T cells，CaN-NFAT）信號(hào)傳導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)［11］。

TRPC通道有7 個(gè)亞型（TRPC1～TRPC7），其中人體TRPC2 是偽基因，不表達(dá)蛋白。TRPC3 參與心肌肥厚和心肌細(xì)胞凋亡2 個(gè)過(guò)程。Yamaguchi 等［12］發(fā)現(xiàn)，TRPC3 參與了體外小鼠心肌細(xì)胞應(yīng)力誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，而在TRPC3基因敲除小鼠中未見(jiàn)這種現(xiàn)象。Shan 等［13］研究表明，在成年小鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)，TRPC3的過(guò)表達(dá)能夠引起心肌細(xì)胞凋亡但不參與心肌細(xì)胞的壞死。Ma等［14］研究表明，長(zhǎng)期高鹽飲食會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體TRPC3的高表達(dá)，增加心肌肥大標(biāo)志物心鈉肽、腦鈉肽和β-肌球蛋白重鏈的表達(dá)，TRPC3的缺失能夠拮抗高鹽飲食誘導(dǎo)的心肌肥大。由此可見(jiàn)，抑制TRPC3將有望成為治療心肌肥厚的潛在新靶點(diǎn)，TRPC3參與高血壓合并LVH 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，但有關(guān)TRPC3基因SNP 多態(tài)性與高血壓合并LVH之間的關(guān)系研究甚少。

本研究基線資料比較結(jié)果顯示，女性、24 h SBP增高者及較高BMI更易發(fā)生LVH，Logistic 回歸分析校正了多重混雜因素后發(fā)現(xiàn)，女性、較高24 h SBP是原發(fā)性高血壓患者發(fā)生LVH 的危險(xiǎn)因素。Gerdts等［15］研究也顯示，女性高血壓患者發(fā)生LVH的風(fēng)險(xiǎn)更高。同時(shí)本研究結(jié)果亦與Framingham 心臟研究結(jié)果［16-17］和亞洲高血壓合并左心室肥厚診治專家共識(shí)［6］中 展 示 的 結(jié) 果 相 近 。 2 組Rs4995894和Rs4292355位點(diǎn)在等位基因頻率、基因型頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Rs2292232位點(diǎn)基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故推測(cè)Rs2292232位點(diǎn)的變異可能是高血壓合并LVH 的遺傳易感因素。Logistic 回歸分析顯示，Rs2292232位點(diǎn)TT 基因型是原發(fā)性高血壓患者發(fā)生LVH 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示TRPC3基因Rs2292232位點(diǎn)的基因多態(tài)性與高血壓合并LVH存在較大關(guān)聯(lián)。筆者推測(cè)TRPC3基因Rs2292232位點(diǎn)的基因多態(tài)性對(duì)高血壓合并LVH 的影響的可能機(jī)制為：（1）TRPC3可能通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度變化，使心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+維持高水平狀態(tài)，激活CaN-NFAT，造成多種心肌肥厚的相關(guān)基因表達(dá)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞體積增大。（2）二?；视屯ㄟ^(guò)TRPC3誘導(dǎo)的Ca2+信號(hào)通路參與了血管緊張素Ⅱ激活NFAT的過(guò)程，從而導(dǎo)致心肌肥厚。（3）TRPC3自身可能直接誘導(dǎo)心肌肥厚。（4）TT 基因型可能影響或改變心肌細(xì)胞TRPC3的活性及分布。

綜上所述，TRPC3基因Rs2292232位點(diǎn) SNP 與原發(fā)性高血壓患者發(fā)生LVH 有關(guān)，其中TT 基因型、女性、較高24 h SBP 為原發(fā)性高血壓患者發(fā)生LVH的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。臨床工作中需要對(duì)高血壓高危人群開(kāi)展易感基因的早期篩檢，防控危險(xiǎn)因素，使臨床治療趨于個(gè)體化，以減少靶器官損害、降低心血管風(fēng)險(xiǎn)。