耿潔，劉濤，姜錦，李光，黃志偉，王玉亮

誘導機體對自身抗原及移植物的耐受仍是免疫學科中的一項重大挑戰(zhàn)。近年研究顯示，T 細胞的活化與效應反應在自身免疫性疾病和急慢性移植排斥反應中占據(jù)主要地位［1］?？烧T導共刺激分子（inducible co-stimulator，ICOS）是機體T 細胞免疫應答過程中重要的共刺激分子，其表達于活化的T 細胞表面，對維持效應T細胞的活化、調(diào)節(jié)CD4+T細胞的功能及調(diào)控T 細胞依賴性B 細胞具有重要的作用［2］。將ICOS的胞外片段與人免疫球蛋白（Ig）G Fc段基因融合而構建的融合蛋白ICOSIg 可阻斷ICOS共刺激信號，從而抑制自身免疫性疾病進展和慢性排斥反應，有助于免疫耐受的建立。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stromal cells，MSCs）作為細胞和基因治療的載體，因發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)與損傷修復的雙重功能成為誘導特異性免疫耐受的治療工具。Takahashi等［3］研究顯示，MSCs與共刺激阻滯相結合可獲得較高的胰島移植物存活率。本文擬構建ICOSIg 基因修飾的脂肪間充質(zhì)干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs），旨在為后期免疫耐受機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料 健康SPF級雄性Lewis大鼠購自解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；胰蛋白酶，成骨、成脂及成胰島樣細胞誘導試劑（美國Sigma公司）；細胞標記抗體（美國BD 公司）；TRIzol RNA 提取試劑盒（美國Invitrogen 公司）；MiniBEST凝膠DNA回收試劑盒（日本TaKaRa公司）；質(zhì)粒載體 pcDNA3.1(+)、瓊脂糖（美國 Invitrogen 公司）；EcoR Ⅰ、BamHⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶（美國Thermo公司）；氨芐青霉素（Amp，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；DH5α感受態(tài)大腸桿菌、LB培養(yǎng)基和LB瓊脂培養(yǎng)基、放免分析（RIPA）裂解緩沖液、5%BSA封閉液（北京索萊寶科技有限公司）；AxyPrep質(zhì)粒小量提取試劑盒（美國Corning公司）；Amaxa 轉染試劑盒（德國Amaxa 公司）；GAPDH 抗體（美國Thermo Fisher 科技公司）；重組Anti-ICOS 抗體（美國Abcam 公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（美國Abbkine公司）。梯度聚合酶鏈式反應（PCR）熱循環(huán)儀（德國Eppendorf 公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Alpha Innotech公司）；核酸/蛋白電泳設備（北京六一儀器廠）；FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 大鼠ICOS 胞外區(qū)編碼序列的獲得及合成 取雄性Lewis 大鼠1 只，收集外周血置于潔凈的離心管中，EDTA 抗凝。淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，按TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，以oligod（T）為引物逆轉錄為cDNA。PCR擴增大鼠ICOS胞外區(qū)。另取人ADSCs細胞總RNA逆轉錄生成的cDNA 文庫，PCR 擴增人IgG Fc 段編碼序列。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，分別切膠回收401 bp的ICOS胞外區(qū)片段和1 012 bp的人IgG Fc片段。ICOS片段用BamHⅠ-EcoRⅠ雙酶切，IgG Fc 片段用EcoRⅠ-XhoⅠ雙酶切，再次1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。

1.3 IgG Fc 克隆插入 pcDNA3.1（+）質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）（EcoRⅠ-XhoⅠ雙酶切）8 μL，EcoRⅠ-XhoⅠ雙酶切后的IgG Fc 片段2 μL，10×buffer 1.2 μL，T4 DNA 連接酶0.8 μL，室溫（約22 ℃）反應4 h。取連接反應產(chǎn)物6 μL，熱休克法轉化DH5α 感受態(tài)大腸桿菌，鋪LB/Amp+LB 瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜。無菌吸頭挑取數(shù)個單克隆菌落，接種于2 mL LB/Amp+LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜。堿裂解法小量提取質(zhì)粒。質(zhì)粒產(chǎn)物進行EcoRⅠ-XhoⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，若出現(xiàn)約1 000 bp的目的條帶則初步鑒定為正確的重組質(zhì)粒。質(zhì)粒產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定其正確性，重組成功的質(zhì)粒命名為pcDNA3.1（+）/IgG Fc。

1.4 pcDNA3.1（+）/ICOSIg 融合基因表達載體的構建 pcDNA3.1（+）/IgG Fc（BamHⅠ-EcoRⅠ雙酶切）2 μL，大鼠ICOS 胞外區(qū)序列（BamHⅠ-EcoRⅠ）8 μL，10×buffer 1.2 μL，T4 DNA連接酶0.8 μL，室溫反應4 h。取連接反應產(chǎn)物6 μL，熱休克法轉化DH5α 感受態(tài)大腸桿菌，鋪LB/Amp+LB 瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。無菌吸頭挑取數(shù)個單克隆菌落，接種于2 mL LB/Amp+LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜。堿裂解法小量提取質(zhì)粒。質(zhì)粒產(chǎn)物進行BamHⅠ-EcoRⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，若出現(xiàn)約400 bp 的目的條帶，則初步鑒定為正確的重組質(zhì)粒，命名為pcDNA3.1（+）/ICOSIg。重組質(zhì)粒最終經(jīng)過測序鑒定。

1.5 大鼠ADSCs 分離培養(yǎng)及鑒定 另取雄性Lewis 大鼠1只，無菌技術下取單側腹股溝脂肪墊，剪成1 mm3左右的小塊后用D-Hanks 液洗滌至清亮后，加入Ⅰ型膠原酶消化，在37 ℃空氣搖床中保持100 次/min 的速度進行震蕩消化為乳糜狀，加入D-Hanks液后離心去除上層乳糜層。加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸細胞。細胞懸液過100 目濾網(wǎng)。取融合達90%的第2代ADSCs，應用流式細胞儀對細胞表面標志物進行鑒定，應用特定的染色方法鑒定ADSCs體外誘導多向分化的潛能。

1.6 重組質(zhì)粒轉染ADSCs 細胞 ADSCs 消化成單細胞懸液，用Amaxa轉染試劑盒重懸ADSCs，調(diào)整細胞密度為5×106/mL。取100 μL的電轉液細胞懸液至1.5 mL Ep管中，加2 μg的pcDNA3.1（+）/ICOSIg 質(zhì)?；靹蚝?，立即轉至電轉杯中，使用Amaxa高效電轉儀通過預先設定的程序轉染，程序結束后立即加入預溫至37 ℃的完全培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.7 Western blot分析ADSCs中ICOSIg表達 重組質(zhì)粒轉染ADSCs后72 h，用RIPA裂解液裂解ADSCs細胞，提取細胞總蛋白。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白電泳轉移到聚二氟乙烯（PVDF）膜上。把膜放置在5%BSA 封閉液中孵育1 h，室溫下膜和重組Anti-ICOS 抗體4 ℃孵育過夜，再用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫下和膜孵育1 h，洗滌3 次，用增強化學發(fā)光（ECL）反應顯色陽性條帶，以GAPDH為內(nèi)參。

2 結果

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定EcoRⅠ-XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/ICOSIg，電泳結果顯示目的基因條帶對應1 000 bp，見圖1。BamHⅠ-EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/ICOSIg，電泳結果顯示目的基因條帶對應400 bp，見圖1。所有酶切鑒定結果與理論預期相符，提示插入基因正確。

2.2 重組質(zhì)粒的測序鑒定 選擇酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒，將其中的插入片段經(jīng)測序鑒定，與GenBank上公布的目標序列完全一致，無插入、缺失和移碼突變，表明質(zhì)粒構建正確，見圖2。

Fig.1 Validation of the recombinant plasmid pcDNA3.1(+)/ICOSIg圖1 pcDNA3.1（+）/ICOSIg質(zhì)粒的酶切鑒定

2.3 大鼠ADSCs 的體外培養(yǎng)和鑒定 ADSCs 傳代后細胞形態(tài)均一，主要呈長梭形，并呈幾何倍數(shù)穩(wěn)定增長。流式細胞儀檢測ADSCs 表面標志顯示，CD90、CD105 和CD73 表達均＞95%，呈陽性；造血干細胞表面標志CD34、白細胞共同抗原CD45 表達均呈陰性。在成脂、成骨及成胰島樣細胞誘導液培育下，細胞能夠誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞和成胰島樣細胞，進一步證實培養(yǎng)細胞為具有多向分化潛能的干細胞。見圖3。

2.4 目的蛋白在ADSCs 細胞中的表達 將重組質(zhì)粒轉染ADSCs 細胞后，Western blot 結果顯示，ICOSIg在ADSCs中高表達，見圖4。

3 討論

Fig.2 DNA sequencing graph of pcDNA3.1(+)/ICOSIg圖2 pcDNA3.1（+）/ICOSIg重組質(zhì)?；驕y序圖

Fig.3 ADSCs were induced to differentiate into adipocytes,osteoblasts and islet-like cells(×200)圖3 ADSCs誘導分化為成脂細胞、成骨細胞及成胰島樣細胞（×200）

Fig.4 Expression of ICOSIg detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測ICOSIg融合蛋白在ADSCs細胞中的表達

3.1 構建ICOSIg 融合基因真核表達載體的意義 隨著人們對免疫系統(tǒng)機制研究的深入，共刺激分子融合蛋白在免疫性疾病治療中的應用前景值得關注。改善共刺激阻斷劑的體內(nèi)分布、增強藥物局部濃度并延長藥物代謝時間具有重要的研究價值。Fc融合蛋白的使用增加了疏水蛋白的溶解性，并通過增大分子質(zhì)量延長蛋白的半衰期，同時增加了多價配體結合的親和力，從而更適于體內(nèi)應用［4］。除此之外，F(xiàn)c 段具有介導補體依賴的細胞毒作用，可以結合Fc 受體，并介導抗體依賴性細胞毒性（ADCC）效應。目前，國內(nèi)少見ICOSIg 真核表達載體的構建及相關的應用研究。本實驗所構建的pcDNA3.1（+）/ICOSIg 質(zhì)粒DNA 序列測序鑒定結果表明與目標序列完全匹配，無插入、缺失和移碼突變，成功構建了真核表達重組質(zhì)粒。ICOS與可誘導共刺激分子配體（ICOSL）相互作用所提供的共刺激信號對觸發(fā)T細胞的關鍵活動起著重要作用，包括產(chǎn)生細胞因子、在不同的疾病模型中調(diào)節(jié)不同的T輔助細胞亞群及分化為輔助性T（Th）17 細胞和T 濾泡輔助（Tfh）細胞［2］。ICOS-ICOSL 通路在 T 細胞活化和移植免疫過程中起關鍵作用，因此它可作為治療自身免疫性疾病和移植排斥反應的理想靶點。利用ICOSIg 阻斷ICOS-ICOSL 通路已在動脈內(nèi)皮細胞移植［5］、心臟移植［6］以及移植物抗宿主病（GVHD）［7］動物模型中觀察到移植物存活率增加。也有研究報道了相反的結果，ICOSIg 輸注不能延長非人靈長類動物模型中移植物的存活時間，原因可能有：（1）ICOSIg與抗原提呈細胞（APC）上配體的結合也阻斷了ICOS 與ICOSL 的相互作用，可能直接影響表達 ICOS 的其他 T 細胞亞群［8］。（2）ICOSIg的使用劑量可能不足以與APC上ICOSL作用完全，這一解釋也得到了劑量增加實驗的支持［9］。故應用融合蛋白技術及基因轉染的細胞治療技術解決共刺激阻斷劑的半衰期短和劑量問題在移植排斥和自身免疫性疾病領域具有實際的應用價值。

3.2 ADCS的應用優(yōu)勢 近年來，細胞療法在實體器官移植中受到了廣泛關注，其中以MSCs 療法為主的治療手段得到了大力發(fā)展。使用ADSCs 作為細胞載體具有一定的潛在的優(yōu)越性，包括：（1）取材方便，創(chuàng)傷小，給患者帶來的痛苦少，治療材料來源充足。（2）能作為免疫治療和基因治療的載體。（3）能按標準方法大規(guī)模生產(chǎn)。（4）自體細胞移植不涉及倫理問題。因此ADSCs 是一種在細胞治療和組織再生領域具有臨床應用前景的種子細胞。

3.3 ICOSIg 基因修飾ADSCs 的表達及意義 研究顯示，利用基因工程技術將共刺激分子融合蛋白基因轉染至MSCs在誘導免疫耐受中具有協(xié)同作用［10］。即當MSCs 遷移到目標組織時，共刺激分子融合蛋白可以在局部持續(xù)釋放，同時持續(xù)發(fā)揮MSCs的旁分泌效應，從調(diào)節(jié)免疫應答、修復受損組織等多個方面參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程，并且不存在諸如常規(guī)免疫抑制劑帶來的全身不良反應。近年來，細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4 融合蛋白（CTLA-4Ig）和OX40Ig 基因修飾的MSCs在多種自身免疫性疾病與移植模型的實驗研究中有一定進展，并顯示出協(xié)同效應［10-11］。本研究將pcDNA3.1（+）/ICOSIg 重組質(zhì)粒核轉染 ADSCs，發(fā)現(xiàn)ICOSIg在ADSCs細胞中的表達水平均明顯升高，表明重組質(zhì)粒能夠成功介導融合蛋白在真核細胞中的表達，是否對免疫應答具有協(xié)同抑制效應還有待進一步的實驗研究。