徐楊，肖斌，魏嵋，代榮陽，向遠彩△

膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）是一種惡性膽管上皮性瘤［1］。近年來，CCA 的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐步攀升［2］。目前，手術(shù)切除是臨床治療CCA的主要手段，但僅對早期患者有效。由于膽管特殊的解剖學位置、檢測手段局限以及發(fā)病隱匿等因素，導致大部分患者發(fā)病時已處于不宜手術(shù)的中晚期，所以局部或全身化療仍是這類人群的主要治療方式。目前，化療對CCA的治療效果不甚理想，因此，亟待尋找新的治療CCA的有效方法。

天然藥物對機體的不良反應小，且具有抗腫瘤細胞突變、促進腫瘤DNA損傷以及抑制腫瘤細胞增殖等特點，在治療腫瘤方面具有較大的潛力，近幾年逐漸成為抗腫瘤領(lǐng)域的研究熱點［3］。黃芩苷（Baicalin，BC）又名貝加靈，是從植物黃芩的根中提取的一種重要的黃酮類化合物［4］，對肝癌、胃癌和乳腺癌等腫瘤具有顯著的抑制作用［5］。深入研究發(fā)現(xiàn)，BC 可通過降低腫瘤細胞轉(zhuǎn)移抑制腫瘤生長［6］。然而，BC對CCA的作用及機制尚不明確。本研究以人源CCA 細胞QBC939 和RBE 為研究對象，探究黃芩苷對CCA細胞增殖的影響及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 CCA細胞QBC939和RBE（北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司，中國）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國）；胎牛血清（Biological Industries 公司，以色列）；黃芩苷單體（Sigma-Aldrich公司，德國）；CCK-8試劑盒、細胞周期與凋亡檢測試劑盒、RIPA細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、100 U/mL 青霉素和0.1 g/L 鏈霉素混合溶液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國）；0.2 μm 硝酸纖維素膜（GE Healthcare 公司，英國）；兔抗周期素依賴激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitor，p27）單克隆抗體、兔抗細胞周期蛋白D1（cyclin protein D1，Cyclin D1）單克隆抗體、兔抗原癌基因蛋白質(zhì)（proto-oncogene proteins，c-Myc）單克隆抗體、鼠抗內(nèi)參β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔及山羊抗鼠 IgG 二抗、RNA 干擾陰性對照（siRNA-Negative Control，si-NC）及 c-Myc 干擾 RNA（siRNA-c-Myc，si-c-Myc，貨號6552S，Cell Signaling Technology 公司，美國）；Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑盒（賽默飛公司，美國）；多功能酶標儀（伯騰儀器有限公司，美國）；流式細胞儀（BD Bioscience公司，美國）；紅外成像儀（Odyssey公司，美國）。

1.2 細胞培養(yǎng)及干預 將QBC939 和RBE 細胞置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱（95%濕度，5%CO2）中，并用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清+1%青霉素和鏈霉素溶液）培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞，將其接種于60 mm 培養(yǎng)皿中生長，當細胞匯合度達到80%時進行實驗。黃芩苷單體經(jīng)二甲基亞砜（DMSO）稀釋至200 mmol/L后，放置-20 ℃儲存。藥物處理時，棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，更換為含相應濃度黃芩苷的新鮮培養(yǎng)基，然后置于培養(yǎng)箱24 h后提取蛋白進行后續(xù)實驗。

1.3 CCK-8法檢測CCA細胞增殖活性 參照CCK-8試劑盒說明書，96孔板中接種細胞懸液（每孔100 μL，約1×104個細胞），置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。（1）黃芩苷對CCA 細胞增殖活性影響實驗。設(shè)置空白對照組（僅含培養(yǎng)基）、對照組（0 μmol/L 的黃芩苷）和6 個實驗組（12.5、25、50、100、200、400 μmol/L黃芩苷），每組設(shè)置4個復孔，隨后用完全培養(yǎng)基將黃芩苷母液稀釋成相應濃度，并以100 μL/孔替換實驗組原培養(yǎng)基。（2）敲低c-Myc 對CCA 細胞增殖活性影響實驗。設(shè)置空白對照組、對照組（si-NC）和3 個實驗組（BC、si-c-Myc、BC+si-c-Myc），根據(jù)組別分別使用BC和si-c-Myc處理細胞。待培養(yǎng)24 h 后，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 檢測混合液（90 μL 培養(yǎng)基+10 μL CCK-8 溶液），置于37 ℃溫育2 h。在酶標儀上設(shè)置對應孔位，讀取450 nm的吸光度（A）。計算細胞存活率（%）=［A（實驗）-A（空白）］/［A（對照）-A（空白）］×100%。并繪制生長柱狀圖。實驗重復3次。

1.4 顯微鏡觀察細胞生長 6 孔板中接種細胞懸液（每孔2 mL，約2×105個細胞），置于恒溫培養(yǎng)箱24 h，待細胞匯合度達70%時，用 50、100 和 200 μmol/L 黃芩苷培養(yǎng) 24 h 后，在高倍顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)并拍照。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 用DMSO（0.1%）和黃芩苷（200 μmol/L）處理QBC939 和 RBE 細胞24 h 后，棄掉原培養(yǎng)基，用預冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗2 次。然后加入適量胰酶消化液，數(shù)秒后，用適量的完全培養(yǎng)基終止消化，并將細胞收集到離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，再加入1 mL 預冷的PBS 后離心，重復清洗2 次，去除殘留的胰酶。隨后加入適量預冷的70%乙醇，輕輕吹打細胞。置于-20 ℃固定過夜。次日，經(jīng)1 000 r/min離心5 min后棄上清，用預冷的PBS 清洗2 次去除殘留乙醇，然后按照試劑盒細胞周期檢測的操作步驟操作并上機檢測。實驗重復3次。

1.6 細胞轉(zhuǎn)染 當QBC939 和RBE 細胞生長到70%匯合度時，用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑瞬時轉(zhuǎn)染si-NC、si-c-Myc（50 nmol/L），8 h 更換含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)16 h，再用200 μmol/L的黃芩苷處理細胞。

1.7 蛋白免疫印跡（Western blot）實驗檢測p27、Cyclin D1及c-Myc蛋白表達 用RIPA細胞裂解液裂解細胞，超聲破碎3次（5 s/次），隨即冰上放置30 min，12 000 r/min 離心15 min。取上清，采用BCA 法進行蛋白定量。取等量的蛋白樣品（50 μg），并加入1/3體積的蛋白上樣緩沖液，渦旋混勻后，放置金屬浴中100 ℃變性10 min，然后置于冰上冷卻。將制備好的樣品用10%十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離蛋白（80～120 V），隨后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（NC）上，并用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后用0.5%TBST清洗3次（5 min/次）。截取不同位置的條帶并用相應的蛋白一抗，p27（1∶2 000）、Cyclin D1（1∶2 000）、c-Myc（1∶2 000）、β-actin（1∶5 000），于4 ℃孵育過夜。待孵育完成后，用TBST 清洗3次（每次5 min），隨后分別加入相應的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）和辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG二抗（1∶10 000），在室溫避光孵育1 h。最后再用TBST 清洗3 次，并用Odyssey 紅外成像系統(tǒng)顯色曝光。各條帶的灰度值用Image J軟件進行分析。實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件分析完成。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，2組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷抑制CCA 細胞增殖活性 CCK-8 實驗結(jié)果顯示，與 0 μmol/L 組相比，12.5、25、50、100、200、400 μmol/L 黃芩苷處理組的 QBC939 和 RBE 細胞的存活率降低，見圖1A、B。在高倍顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，隨著黃芩苷處理組濃度的增加，QBC939 和RBE 細胞的生長速度明顯變緩，這在200 μmol/L 處理組中尤為明顯，見圖1C、D。由此，選取200 μmol/L黃芩苷作為后續(xù)實驗的給藥濃度。

2.2 黃芩苷阻滯CCA 細胞的細胞周期 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比，200 μmol/L黃芩苷處理細胞24 h后，QBC939細胞的S期細胞比例明顯增加，但對RBE細胞周期沒有明顯影響，見圖2A、B。Western blot 進一步檢測發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可顯著性下調(diào)S 期輔助性的周期蛋白Cyclin D1，并上調(diào)周期素依賴激酶抑制劑p27的蛋白水平，見圖2C、D。

2.3 黃芩苷抑制c-Myc 蛋白表達 Western blot 結(jié)果顯示，與 0 h 組相比，12 h 和 24 h 200 μmol/L 黃芩苷處理QBC939和RBE 細胞后可顯著降低c-Myc 的蛋白表達，且處理時間越長，抑制作用越明顯，見圖3A、B。此外，不同濃度的黃芩苷處理細胞24 h后，與0 μmol/L 組相比，50、100、200 μmol/L c-Myc 的蛋白表達明顯減少，見圖3C、D。

2.4 黃芩苷通過抑制c-Myc 降低CCA 細胞增殖活性 Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，用siRNA敲低QBC939和RBE細胞中的c-Myc后，p27蛋白的表達水平明顯增加，同時Cyclin D1 顯著下調(diào)，這與黃芩苷處理時的變化一致。此外，與單獨的黃芩苷處理組相比，敲低c-Myc 聯(lián)合黃芩苷處理后，p27 蛋白的表達顯著增加，Cyclin D1 蛋白的表達明顯減少（均P＜0.05），見圖4A、B。并且，細胞增殖活性檢測也發(fā)現(xiàn)，單獨敲低c-Myc 后可明顯抑制QBC939 和RBE 細胞的存活率；敲低c-Myc 與黃芩苷聯(lián)用時，2種細胞的存活率（%）與單獨敲低c-Myc組相比均進一步降低（均P＜0.05），見圖4C、D。

3 討論

Fig.1 Effectsofbaicalinontheproliferationofcholangiocarcinomacells圖1 黃芩苷對膽管癌細胞增殖的影響

3.1 CCA 的研究現(xiàn)狀 CCA 是一種膽管上皮的惡性實體瘤，起病隱匿，且易發(fā)生轉(zhuǎn)移［7］。CCA的發(fā)病機制常與年齡偏高、膽管結(jié)石、慢性膽管炎、肝炎、肝硬化、吸煙、化學毒素及寄生蟲感染等相關(guān)［8］。當前最常用的化療手段是順鉑與吉西他濱聯(lián)合治療，但大范圍使用不僅會引起腫瘤耐藥性，而且對患者肝腎等器官有較大的損害。即便如此，患者的平均生存期仍不超過21.4個月［9］。本文探究了天然黃酮類化合物黃芩苷對CCA 細胞的作用，結(jié)果顯示黃芩苷能顯著抑制2種CCA細胞的增殖活性。

Fig.2 Effects of baicalin on the cell cycle of cholangiocarcinoma cells圖2 黃芩苷對膽管癌細胞周期的影響

Fig.3 Effects of baicalin on the expression of c-Myc protein of cholangiocarcinoma cells圖3 黃芩苷對膽管癌細胞中c-Myc蛋白表達的影響

Fig.4 Effects of baicalin on the protein expression of cell cycle and survival rate through inhibiting the protein expression of c-Myc圖4 黃芩苷抑制c-Myc蛋白表達對周期蛋白表達及細胞存活率的影響

3.2 黃芩苷阻滯CCA細胞周期 鏡下觀察到黃芩苷可抑制CCA 細胞生長，提示黃芩苷可能抑制細胞周期進程。本研究采用Western blot檢測周期相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)黃芩苷可調(diào)節(jié)Cyclin D1與p27的蛋白表達水平，提示黃芩苷可能阻滯CCA 細胞周期。早期的研究揭示Cyclin D1 與S 期進程受阻有關(guān)［10］。為進一步明確黃芩苷對CCA細胞周期的影響，本研究流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，黃芩苷處理后QBC939細胞的S期細胞比例增多。上述結(jié)果表明Cyclin D1 及p27 蛋白的改變可能與S 期的阻滯有關(guān)，這與 Zhu 等［11］報道的黃芩苷下調(diào) Cyclin D1 導致人膠質(zhì)母細胞瘤細胞U87 和U251 的細胞周期S期停滯的結(jié)果相似。此外，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，黃芩苷不影響CCA 細胞S 期向G2 期過渡，而是促進QBC939細胞由G1期進入S期，對RBE細胞周期進程無影響，這可能與2種細胞的遺傳背景不同有關(guān)［12］。然而，黃芩苷處理后2種細胞的增殖活性下降，推測黃芩苷可能通過調(diào)控如S期激酶相關(guān)蛋白2等使處理的細胞過早地由G1期進入S期，從而導致細胞內(nèi)的功能紊亂，最終抑制細胞增殖［13］。以上結(jié)果說明黃芩苷可通過調(diào)控周期相關(guān)蛋白影響CCA細胞的周期進程。

3.3 黃芩苷通過下調(diào)c-Myc蛋白表達調(diào)控CCA細胞周期蛋白 細胞內(nèi)如c-Myc 等一系列重要的癌基因在細胞生長的調(diào)控中起重要作用。本研究顯示，敲低c-Myc后影響了周期蛋白Cyclin D1與p27的表達，且顯著抑制細胞增殖，這提示黃芩苷確實可以通過c-Myc 調(diào)控CCA 細胞周期。已有研究表明c-Myc 的下調(diào)可降低QBC939 細胞的體外侵襲性［14］。近期研究也顯示，用c-Myc輔助轉(zhuǎn)錄激活因子抑制劑JQ1 抑制c-Myc 的功能后可有效地阻止CCA 異種移植瘤的生長［15］。本課題組前期實驗也發(fā)現(xiàn) CCA 的發(fā)生與 c-Myc 蛋白失調(diào)密切相關(guān)［16］。這些證據(jù)提示c-Myc 可能是黃芩苷抑制CCA 細胞增殖的靶基因，但黃芩苷如何下調(diào)c-Myc，以及體外針對CCA 治療的效果如何等方面仍不明確，有待進一步研究。

綜上所述，黃芩苷可通過下調(diào)c-Myc調(diào)控CCA細胞周期蛋白，進而降低細胞增殖活性，這將為尋找CCA治療的新方法提供理論依據(jù)。