陳國(guó)慶，葉萍，徐玲，謝曉英△

線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生腺苷三磷酸（ATP）以維持生命活動(dòng)的重要細(xì)胞器，在低氧條件下，線粒體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），誘發(fā)強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)而導(dǎo)致缺氧性細(xì)胞損傷［1］。卵巢癌細(xì)胞由于生長(zhǎng)迅速、代謝活躍、耗氧量大而常處于低氧環(huán)境中。然而卵巢癌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)完整、數(shù)量豐富，極少出現(xiàn)缺氧性細(xì)胞損傷，其抗缺氧損傷機(jī)制暫未完全闡明。線粒體自噬是在低氧等不良環(huán)境下細(xì)胞自我吞噬、清除受損線粒體以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。筆者前期研究已證實(shí)卵巢癌細(xì)胞自噬與增殖的關(guān)系［2］，然而有關(guān)線粒體自噬與卵巢癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系報(bào)道罕見。B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因/腺病毒E1B 相互作用蛋白3（BNIP3）是定位于線粒體外膜的蛋白，在特定條件下與自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）介導(dǎo)自噬從而清除受損線粒體［3］。卵巢癌細(xì)胞是否通過BNIP3調(diào)控線粒體自噬來維持在低氧條件下繼續(xù)向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移目前尚未明確。本研究將模擬卵巢癌體內(nèi)低氧環(huán)境，應(yīng)用人高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞株HO-8910PM 制作體外低氧細(xì)胞模型，分析低氧條件下BNIP3 的表達(dá)變化，以及該條件下抑制BNIP3 表達(dá)對(duì)細(xì)胞線粒體自噬的影響，并分析細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移功能的變化，為進(jìn)一步明確卵巢癌可能的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要試劑及設(shè)備 人高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞系HO-8910PM 由重慶醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室贈(zèng)與。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶等購(gòu)自南京沃利爾斯生物技術(shù)有限公司；BNIP3 siRNA 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成；Transwell小室購(gòu)自Corning公司；BNIP3及LC3-Ⅱ單克隆抗體（一抗）購(gòu)自深圳市牛啟生物技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）及Western blot實(shí)驗(yàn)等相關(guān)試劑盒購(gòu)自賽恩斯（深圳）生命科學(xué)有限公司。H-7500 型透射電鏡購(gòu)自日本HITACHI公司；PCR儀、化學(xué)顯像儀等購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad。

1.2 低氧模型設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)分組 取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期HO-8910PM細(xì)胞應(yīng)用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分為3組：常氧組、低氧組、低氧+BNIP3 siRNA組，其中常氧組氣體條件為20%O2、5%CO2、75%N2；而低氧組、低氧+BNIP3 siRNA 組的氣體條件為2%O2、5%CO2、93%N2。上述各組細(xì)胞先按常規(guī)環(huán)境孵育12 h，待細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期且密度在60%～80%時(shí)，參照不同氣體條件分組處理48 h，每組均為5個(gè)樣本。

1.3 BNIP3 siRNA 轉(zhuǎn)染 應(yīng)用胰蛋白酶將生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期HO-8910PM 細(xì)胞消化并制作細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸接種在6 孔板上，并使每孔細(xì)胞為1.0×105個(gè)。常規(guī)培養(yǎng)12 h 待細(xì)胞貼壁后，在低氧+BNIP3 siRNA 組加入終濃度為5 nmol/L 的BNIP3 siRNA 并放置于低氧條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染，處理48 h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 吖啶橙染色分析線粒體自噬情況 各組細(xì)胞在培養(yǎng)結(jié)束前10 min 加入終濃度為1 mg/L 的吖啶橙染液進(jìn)行活體染色，后去除含吖啶橙的培養(yǎng)液，并應(yīng)用無菌PBS 液反復(fù)清洗細(xì)胞，最后應(yīng)用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況。線粒體自噬小體為酸性小體，將被吖啶橙染為紅色，而未發(fā)生線粒體自噬的細(xì)胞漿，將呈現(xiàn)綠色熒光。在400 倍鏡下計(jì)數(shù)500 個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞所占比率作為細(xì)胞自噬率。

1.5 透射電鏡觀察細(xì)胞線粒體自噬小體 各組細(xì)胞經(jīng)處理后在2.5%的戊二醛溶液中低溫固定12 h，應(yīng)用1%鋨酸再次固定，經(jīng)乙醇與丙酮梯度脫水、環(huán)氧樹脂618浸透、包埋等步驟后，制成70 nm超薄切片，使用枸櫞酸鉛和醋酸鈾進(jìn)行電子染色。將切片置于透射電鏡下，觀察各組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，重點(diǎn)觀察線粒體自噬小體的產(chǎn)生情況，以及其他超微結(jié)構(gòu)的改變，并將發(fā)現(xiàn)3個(gè)以上線粒體自噬小體的細(xì)胞視為陽性細(xì)胞，隨機(jī)觀察100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞自噬體發(fā)生率。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移率 應(yīng)用生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期HO-8910PM細(xì)胞制作細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL，將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)24 h后在培養(yǎng)板底部劃痕，并應(yīng)用無菌PBS將劃痕脫落的懸空細(xì)胞除去后進(jìn)行分組處理。分別置于常氧和低氧條件下孵育48 h后，于顯微鏡下觀察劃痕部位的細(xì)胞分布情況，并計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移率：低氧組（或BNIP3 siRNA+低氧組）遷移細(xì)胞數(shù)/常氧組遷移細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲率 取出Transwell 小室，置于4 ℃預(yù)冷，按1∶8比例用PBS緩沖液配制Matrigel膠工作液，取此工作液100 μL從小室內(nèi)壁緩慢注入完成鋪膠，37 ℃條件下放置30 min備用。取24孔板并向其注入包含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液600 μL/孔，將小室放置于24孔板中，向小室加入細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液各100 μL。按常氧及低氧條件培養(yǎng)48 h，后經(jīng)去除上室未穿膜細(xì)胞、固定、伊紅染色。在200 倍光鏡下，隨機(jī)讀取10 個(gè)視野，計(jì)數(shù)膜背側(cè)的穿膜數(shù)，并計(jì)算侵襲率：低氧組（或BNIP3 siRNA+低氧組）穿膜細(xì)胞數(shù)/常氧組穿膜細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8 qPCR檢測(cè)BNIP3及LC3-Ⅱ的基因表達(dá) 應(yīng)用Trizol試劑提取已經(jīng)處理48 h 的細(xì)胞總RNA，對(duì)總RNA 進(jìn)行定量分析并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin作為內(nèi)參基因，分別檢測(cè)BNIP3及LC3-ⅡmRNA 的表達(dá)量。按下述體系進(jìn)行qPCR：SYBR Premix EX TaqTMⅡ 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板cDNA 2 μL，后應(yīng)用無菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。PCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共計(jì)循環(huán)40 次，引物序列見表1，BNIP3及LC3-Ⅱ相對(duì)表達(dá)量以 2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.9 Western blot 檢測(cè)BNIP3 及LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá) 消化、收集3 組經(jīng)處理的HO-8910PM 細(xì)胞，按照Western blot 試劑盒進(jìn)行操作，首先加入細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞，提取總蛋白后采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，后經(jīng)下述步驟進(jìn)行Western blot：SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉抗體，清洗后加入一抗（抗BNIP3 和LC3-Ⅱ），放置4 ℃冰箱過夜，清洗后加入二抗，37 ℃反應(yīng)1 h，再經(jīng)化學(xué)顯色，最后將反應(yīng)膜放入成像儀中分析，用Quantity one軟件分析BNIP3和LC3-Ⅱ蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

Tab.1 Primer sequence of qPCR表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 低氧及轉(zhuǎn)染BNIP3 siRNA 對(duì)HO-8910PM 細(xì)胞線粒體自噬的影響 吖啶橙染色結(jié)果顯示，在低氧條件下，卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞線粒體自噬率顯著增加，在低氧基礎(chǔ)上聯(lián)合轉(zhuǎn)染BNIP3 siRNA 可明顯抑制線粒體自噬（均P＜0.01），見表2、圖1。透射電鏡結(jié)果顯示，在低氧環(huán)境下，HO-8910PM 細(xì)胞胞漿內(nèi)雙膜結(jié)構(gòu)的線粒體自噬小體顯著增多，低氧聯(lián)合轉(zhuǎn)染BNIP3 siRNA 細(xì)胞可見大量線粒體腫脹、崩裂現(xiàn)象，而線粒體自噬小體明顯減少（均P＜0.01）。見表2、圖2。

Fig.1 Mitophagy of HO-8910PM cells stained with acridine orange in three groups(×400)圖1 HO-8910PM細(xì)胞經(jīng)處理后吖啶橙染色線粒體自噬發(fā)生情況（×400）

Fig.2 Mitophagy in HO-8910PM cells under TEM in three groups(×10 000)圖2 HO-8910PM細(xì)胞經(jīng)處理后透射電鏡下線粒體自噬發(fā)生情況（×10 000）

Fig.3 Migration ability of HO-8910PM cells under different treatment factors in three groups(×200)圖3 HO-8910PM細(xì)胞不同處理因素下遷移能力情況（×200）

Fig.4 Changes of invasion ability of HO-8910PM cells under different conditions in three groups(×200)圖4 不同條件下HO-8910PM細(xì)胞侵襲能力變化（×200）

Tab.2 Effects of hypoxia and BNIP3 siRNA on mitophagy rate of HO-8910PM cells表2 低氧及轉(zhuǎn)染BNIP3 siRNA對(duì)HO-8910PM細(xì)胞線粒體自噬率的影響 （n=5，%，）

Tab.2 Effects of hypoxia and BNIP3 siRNA on mitophagy rate of HO-8910PM cells表2 低氧及轉(zhuǎn)染BNIP3 siRNA對(duì)HO-8910PM細(xì)胞線粒體自噬率的影響 （n=5，%，）

＊＊P＜0.01；a與常氧組比較，b與低氧組比較，P＜0.05

組別常氧組低氧組低氧+BNIP3 siRNA組F細(xì)胞自噬率4.31±0.88 35.12±5.99a 4.74±0.94b 124.512＊＊自噬體發(fā)生率3.13±0.46 28.61±4.49a 3.00±0.29b 159.821＊＊

2.2 低氧及轉(zhuǎn)染BNIP3 siRNA 對(duì)HO-8910PM 細(xì)胞遷移能力的影響 低氧條件下細(xì)胞遷移率與常氧條件下差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（96.39%±1.25%vs.100%），而低氧+BNIP3 siRNA 組（27.69%±5.33%）細(xì)胞遷移率較低氧組降低（n=5，F(xiàn)=831.061，P＜0.01），見圖3。

2.3 低氧及轉(zhuǎn)染BNIP3 siRNA 對(duì)HO-8910PM 細(xì)胞侵襲能力的影響 低氧條件下，Transwell 小室穿膜細(xì)胞數(shù)與常氧條件下差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（99.73%±9.69%vs.100%），而低氧+BNIP3 siRNA 組（19.90%±3.25%）較低氧組細(xì)胞侵襲率顯著降低（n=5，F(xiàn)=306.158，P＜0.01），見圖4。

2.4 低氧及轉(zhuǎn)染BNIP3 siRNA 對(duì)BNIP3、LC3-Ⅱ基因表達(dá)的影響 低氧組卵巢癌HO-8910PM 細(xì)胞BNIP3、LC3-Ⅱ的基因表達(dá)量較常氧組顯著升高（P＜0.05），而在低氧條件下轉(zhuǎn)染BNIP3 siRNA 后細(xì)胞BNIP3、LC3-Ⅱ的基因表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Effects of BNIP3 siRNA transfection on the expressions of related genes and proteins in HO-8910PM cells under hypoxia and hypoxia conditions表3 低氧及低氧條件下轉(zhuǎn)染BNIP3 siRNA對(duì)HO-8910PM細(xì)胞相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響（n=5，）

Tab.3 Effects of BNIP3 siRNA transfection on the expressions of related genes and proteins in HO-8910PM cells under hypoxia and hypoxia conditions表3 低氧及低氧條件下轉(zhuǎn)染BNIP3 siRNA對(duì)HO-8910PM細(xì)胞相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響（n=5，）

＊＊P＜0.01；a與常氧組比較，b與低氧組比較，P＜0.05

組別常氧組低氧組低氧+BNIP3 siRNA組F mRNA相對(duì)表達(dá)量BNIP3 1.00±0.00 2.28±0.11a 0.84±0.16ab LC3-Ⅱ1.00±0.00 3.67±0.73a 0.71±0.14b蛋白相對(duì)表達(dá)量BNIP3 0.33±0.06 0.93±0.06a 0.31±0.06b LC3-Ⅱ0.37±0.05 0.91±0.06a 0.27±0.07ab 263.973＊＊72.141＊＊169.800＊＊146.944＊＊

2.5 低氧及轉(zhuǎn)染BNIP3 siRNA 對(duì)BNIP3、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響 低氧組卵巢癌HO-8910PM 細(xì)胞BNIP3、LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)量較常氧組顯著升高（P＜0.05），而在低氧條件下轉(zhuǎn)染BNIP3 siRNA 后細(xì)胞BNIP3、LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），見表3、圖5。

Fig.5 Expressions of BNIP3 and LC3-Ⅱin HO-8910PM cells under different conditions圖5 不同條件下HO-8910PM細(xì)胞BNIP3及LC3-Ⅱ表達(dá)變化

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致卵巢癌患者5年生存率低的重要原因 由于卵巢位于盆腔深處，在本病確診時(shí)大多已處于中晚期，因而常伴癌細(xì)胞廣泛轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致卵巢癌的死亡率居高難下，因此抑制轉(zhuǎn)移是治療卵巢癌亟待解決的重要問題［4］。探明卵巢癌轉(zhuǎn)移的通路和分子機(jī)制是制定抑制轉(zhuǎn)移治療方案的根本途徑。目前有關(guān)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍集中于細(xì)胞在離巢后釋放大量促進(jìn)血管生長(zhǎng)的因子，為新發(fā)癌灶提供血液營(yíng)養(yǎng)，并最終形成轉(zhuǎn)移灶［5-7］。然而，卵巢癌在脫離了原發(fā)灶向遠(yuǎn)處游出時(shí)失去母瘤血供，導(dǎo)致細(xì)胞處于缺血、缺營(yíng)養(yǎng)的微環(huán)境，在新生血管形成前卵巢癌細(xì)胞通過何種機(jī)制避免凋亡而繼續(xù)生存的機(jī)制仍不清楚。

3.2 線粒體自噬是低氧條件下卵巢癌細(xì)胞自我保護(hù)的重要機(jī)制 線粒體是細(xì)胞氧化供能的重要場(chǎng)所，在缺氧條件下，線粒體氧化反應(yīng)障礙可生成大量ROS而受損，同時(shí)發(fā)生線粒體膜電位變化，導(dǎo)致膜內(nèi)外線粒體電解質(zhì)濃度差異常，抑制了相關(guān)酶活性，進(jìn)一步加重線粒體功能障礙，如受損線粒體不及時(shí)清除，會(huì)將大量ROS等釋放至細(xì)胞質(zhì)中，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［8］。線粒體自噬是細(xì)胞在缺氧等不利環(huán)境下自我吞噬清除線粒體、維持細(xì)胞繼續(xù)生存的生物學(xué)現(xiàn)象［9-10］。筆者推測(cè)卵巢癌細(xì)胞在脫離母瘤后處于低氧環(huán)境，細(xì)胞啟動(dòng)線粒體自噬，及時(shí)清除了受損線粒體，避免了出現(xiàn)缺氧性細(xì)胞損傷，在癌細(xì)胞生成新轉(zhuǎn)移灶、得到新的血供之前發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

BNIP3 是一種線粒體外膜蛋白，可與LC3 等自噬蛋白結(jié)合，介導(dǎo)形成自噬小體并消化線粒體［11］。本研究證實(shí)，卵巢癌HO-8910PM 細(xì)胞在低氧條件下，線粒體外膜蛋白BNIP3表達(dá)量顯著增加，與常氧條件下的細(xì)胞相比其mRNA 的表達(dá)量明顯增加，而經(jīng)過翻譯最終成熟BNIP3蛋白相應(yīng)增加。形態(tài)學(xué)分析可見，低氧條件下細(xì)胞線粒體自噬活性顯著增加。在吖啶橙染色后觀察到細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)大量的紅色嗜酸性染色區(qū)域，而透射電鏡更為直觀地證實(shí)了這一結(jié)果。在透射電鏡下，低氧條件的HO-8910PM細(xì)胞自噬活性明顯增強(qiáng)，胞漿處易見被雙膜結(jié)構(gòu)包裹的線粒體自噬小體，其中線粒體可見形態(tài)異常、腫脹等變化，而自噬體外的線粒體大多完好無損。本研究證實(shí)，在低氧條件下HO-8910PM 細(xì)胞LC3-Ⅱ表達(dá)量顯著增高，上述結(jié)果均提示，低氧條件下細(xì)胞啟動(dòng)線粒體自噬，清除受損的線粒體，這與其他種類細(xì)胞在低氧時(shí)表達(dá)增加的報(bào)道一致［12-13］。本研究結(jié)果證實(shí)，抑制BNIP3 的表達(dá)可顯著抑制低氧環(huán)境時(shí)的線粒體自噬發(fā)生率。透射電鏡觀察到抑制BNIP3的表達(dá)后線粒體自噬小體顯著減少，同時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)典型的缺氧性細(xì)胞損傷的超微結(jié)構(gòu)變化，即線粒體腫脹、崩裂、溶解等，正常形態(tài)的線粒體少見，并可伴細(xì)胞凋亡小體出現(xiàn)。qPCR 及Western blot 實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，抑制BNIP3 的表達(dá)后LC3-Ⅱ表達(dá)量也隨之明顯下降。

3.3 BNIP3 表達(dá)增加促進(jìn)線粒體自噬 本研究顯示，HO-8910PM 細(xì)胞在低氧條件下，通過增加BNIP3 表達(dá)啟動(dòng)線粒體自噬并保護(hù)細(xì)胞，以維持細(xì)胞具有正常的遷移及侵襲能力，因此筆者推測(cè)BNIP3是卵巢癌轉(zhuǎn)移的重要靶點(diǎn)。癌細(xì)胞通過基質(zhì)黏附、運(yùn)動(dòng)緩慢向遠(yuǎn)處游走、轉(zhuǎn)移［14］，在此過程中必須提供大量ATP為黏附、運(yùn)動(dòng)供能，并保障細(xì)胞內(nèi)正常氧化反應(yīng)的進(jìn)行，一旦線粒體功能受損，則出現(xiàn)供能不足，其轉(zhuǎn)移功能受抑。抑制BNIP3 可顯著抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但并不能完全阻止其轉(zhuǎn)移，這提示卵巢癌細(xì)胞還有其他途徑和機(jī)制進(jìn)行離巢后生存和轉(zhuǎn)移。已有研究證實(shí)，高轉(zhuǎn)移性卵巢癌可表達(dá)整合素α5（integrin α5，TGA5），易通過與瘤體組織中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）結(jié)合，形成細(xì)胞球并組成卵巢癌轉(zhuǎn)移單元（metastatic units，MUs），成纖維細(xì)胞能夠促進(jìn)腹水中卵巢癌細(xì)胞的存活，并協(xié)助發(fā)生腹膜浸潤(rùn)［15］。

總之，本研究初步證實(shí)卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞在低氧條件下通過增加線粒體膜蛋白BNIP3的表達(dá)啟動(dòng)線粒體自噬清除受損線粒體，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制。在低氧條件下，抑制BNIP3表達(dá)時(shí)，線粒體自噬顯著受抑，細(xì)胞自我保護(hù)功能被破壞，出現(xiàn)典型的缺氧性細(xì)胞損傷變化，細(xì)胞遷移和侵襲功能均受到明顯抑制，因此推測(cè)BNIP3 是卵巢癌轉(zhuǎn)移的重要靶點(diǎn)。由于線粒體自噬及卵巢癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制均為眾多分子參與的多通路網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，BNIP3 在卵巢癌轉(zhuǎn)移中的詳盡機(jī)制仍待進(jìn)一步探索。