劉晉芳，徐小燕，周儒奎，徐慧超，高艷，苗宇船△

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率較高［1］。全球每年約40 萬女性因卵巢癌死亡，因其發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時已屬晚期且難以治愈，5年生存率僅50%［2］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進步，針對卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、浸潤、遷徙、血管生長等分子生物靶點提出的靶向治療成為卵巢癌診斷治療的重點和熱點［3］?？缒さ鞍?7（transmembrane protein 97，TMEM97）又名腦膜瘤相關(guān)蛋白或MAC30，由Murphy等1993年在分析腦膜瘤相關(guān)蛋白表達(dá)差異時發(fā)現(xiàn)并提出［4］。研究表明TMEM97 mRNA及蛋白在人類多種腫瘤中表達(dá)水平不同，在胰腺癌和腎癌中表達(dá)量較低，在卵巢癌、食管癌、胃癌和結(jié)腸癌中表達(dá)較高［5］。但目前關(guān)于TMEM97在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用鮮有報道。本文檢測了下調(diào)TMEM97后卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖、凋亡能力及其相關(guān)因子表達(dá)的變化，以期為卵巢癌的早期診斷及治療提供理論與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗所用卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞培養(yǎng)中心。RPMI 1640 培養(yǎng)基購于Hyclone 公司，雙抗、胎牛血清、CCK-8 試劑盒、Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑、細(xì)胞周期檢測試劑盒、胰酶、BCA試劑盒購自中國南京凱基生物公司。TMEM97 siRNA、陰性對照siRNA 均由中國廣州銳博生物科技有限公司合成。Opti-MEM 培養(yǎng)基、Lipo3000、Trizol、實時熒光定量PCR（qPCR）相關(guān)試劑、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG 均購自中國北京索萊寶科技公司；TMEM97、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)（Bax）、P38 絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase，P38 MAPK）通路相關(guān)蛋白（P38/MAPK、p-P38/MAPK）抗體均購自美國Sigma 公司；β-actin 抗體購自美國Abcam公司。qPCR儀均購自德國Biometra公司；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad 公司；多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo Scientific 公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司；流式細(xì)胞儀購自美國Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 卵巢癌細(xì)胞系SKOV3 用含有10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1640，37 ℃、5%CO2、飽和濕度的環(huán)境下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時傳代。將卵巢癌細(xì)胞SKOV3分為轉(zhuǎn)染組（si-TMEM97組）、陰性對照組（siNC組）和空白對照組（Control組），前兩組均于細(xì)胞融合度達(dá)60%時進行轉(zhuǎn)染，Control組不作處理。si-TMEM97組細(xì)胞轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L 的siRNA-TMEM97（si-TMEM97）。干擾序列：上游 5′-GAAGCUGCUGCUAAAGCAUUU-3′，下游 5′-AUGCUUUAGCAGCAGCUUCUU-3′。siNC 組細(xì)胞轉(zhuǎn)染相應(yīng)濃度的陰性空白無意義的siRNA（siNC），干擾序列：上游5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ ，下 游 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。按照試劑說明書要求，將Opti-MEM培養(yǎng)基、si-RNA、Lipo3000混合物加入不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，6 h后更換10%的胎牛血清培養(yǎng)基。

1.2.2 qPCR檢測TMEM97的mRNA表達(dá)變化 SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-TMEM97 48 h后，用Trizol提取SKOV3細(xì)胞中的總RNA，將1 μg總RNA加入20 μL混合反應(yīng)體系中進行反轉(zhuǎn)錄。PCR 擴增的寡核苷酸引物：TMEM97 上游5′-ACTGCTCAGAACCCACGTCT-3′，下 游 5′-ATCATGCCACTGCCCTTTAC-3′；β-actin 上游 5′-GGAAATCGTGCGTGACATTA-3′，下游 5′-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3′。PCR 反應(yīng)體系的擴增條件：94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)40 次。按照qPCR 檢測試劑盒說明書進行實驗，整個操作注意避光，并在冰上進行。PCR 擴增反應(yīng)結(jié)束后得到擴增曲線和 Ct 值，結(jié)果用 2-ΔΔCt值表示。ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct管家基因）對照組。以上實驗均重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot 檢測TMEM97、Bcl-2、Bax、P38/MAPK、p-P38/MAPK 的表達(dá)變化 SKOV3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-TMEM97 72 h 后，BCA 試劑盒提取SKOV3 細(xì)胞總蛋白，并測定蛋白濃度。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳跑膠并轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃冰箱孵育過夜（TMEM97 一抗稀釋比例為1∶2 500；Bcl-2、Bax、p-P38/MAPK、P38/MAPK 一抗稀釋比例均為1∶2 000；β-actin 一抗稀釋比例為1∶1 000），PBS洗膜，二抗（1∶1 000）進行室溫孵育，用ECL發(fā)光試劑顯影。使用Image J軟件分析條帶的灰度值。以上實驗均重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞增殖能力檢測 使用CCK-8 試劑盒觀察下調(diào)基因TMEM97對細(xì)胞增殖的影響。將SKOV3細(xì)胞接種到96孔板中，24 h后換100 μL新鮮培養(yǎng)基。siRNA-TMEM97或陰性對照siRNA以100 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞。分別于轉(zhuǎn)染后的0、24、48、72 和 96 h 向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入 10 μL 的 CCK-8 溶液，再孵育2 h，在450 nm處檢測光密度（OD）值，計算細(xì)胞活力。以上實驗均重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞周期檢測 收集處于對數(shù)生長期的卵巢癌細(xì)胞SKOV3 懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105個/mL，鋪于6 孔板中，每孔2 mL。siRNA-TMEM97或陰性對照siRNA以100 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48 h后離心，收集細(xì)胞，棄上清，PBS 清洗3次，并用預(yù)冷的70%乙醇在4 ℃固定過夜，再離心并收集細(xì)胞，清洗重懸之后，加入50 mg/L RNA酶和100 mg/L PI染液，300 目濾網(wǎng)過濾后，流式細(xì)胞儀檢測SKOV3 細(xì)胞周期的變化。以上實驗均重復(fù)3次。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測 將SKOV3 細(xì)胞接種至12 孔板中，siRNA-TMEM97或陰性對照siRNA以100 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48 h后收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的變化。以上實驗均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA-TMEM97 轉(zhuǎn)染后TMEM97 基因和蛋白的表達(dá)變化 qPCR 和Western blot 檢測結(jié)果顯示，si-TMEM97 組能夠明顯抑制TMEM97 mRNA 的表達(dá)，且TMEM97 的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），而Control組和siNC組中TMEM97 mRNA和蛋白水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1、表1。

Fig.1 Expressions of TMEM97 after transfection in SKOV3 cells圖1 轉(zhuǎn)染后TMEM97在SKOV3細(xì)胞中的表達(dá)

Tab.1 Relative expression levels of TMEM97 after transfection in three groups表1 3組轉(zhuǎn)染后TMEM97 mRNA和蛋白的相對表達(dá)量（n=3，）

Tab.1 Relative expression levels of TMEM97 after transfection in three groups表1 3組轉(zhuǎn)染后TMEM97 mRNA和蛋白的相對表達(dá)量（n=3，）

＊＊P＜0.01；a 與 Control 組比較，b 與 siNC 組比較，P＜0.01；表2、3同

組別Control組siNC組si-TMEM97組F TMEM97 mRNA 1.03±0.02 0.95±0.07 0.48±0.04ab 115.232＊＊TMEM97蛋白0.98±0.03 0.88±0.02 0.35±0.05ab 294.160＊＊

2.2 siRNA-TMEM97 轉(zhuǎn)染后SKOV3 的增殖能力變化 CCK-8檢測結(jié)果顯示，相比于Control 組和siNC組，si-TMEM97組24、48、72和96 h細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.01），而Control 組和siNC 組間細(xì)胞活力變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義，下調(diào)TMEM97 的表達(dá)能明顯抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖能力，見表2。

2.3 siRNA-TMEM97 轉(zhuǎn)染后對SKOV3 細(xì)胞周期的影響 細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，相比于Control 組和siNC 組，si-TMEM97 組G1 期的細(xì)胞比例減少（P＜0.01），而G2/M期的細(xì)胞比例明顯增加（P＜0.01），細(xì)胞周期阻滯于G2/M 期，下調(diào)TMEM97 的表達(dá)對SKOV3細(xì)胞具有細(xì)胞周期的阻滯效應(yīng)，見圖2、表3。

Tab.2 Effects of siRNA-TMEM97 transfection on the proliferation of SKOV3 cells表2 轉(zhuǎn)染siRNA-TMEM97對3組SKOV3細(xì)胞增殖能力的影響 （n=3，OD值，）

Tab.2 Effects of siRNA-TMEM97 transfection on the proliferation of SKOV3 cells表2 轉(zhuǎn)染siRNA-TMEM97對3組SKOV3細(xì)胞增殖能力的影響 （n=3，OD值，）

組別Control組siNC組si-TMEM97組F 24 h 0.50±0.03 0.40±0.05 0.27±0.03ab 27.841＊＊48 h 1.05±0.02 0.94±0.02 0.48±0.04ab 342.948＊＊72 h 1.46±0.08 1.19±0.03 0.54±0.07ab 165.215＊＊96 h 1.58±0.02 1.46±0.06 0.68±0.05ab 286.130＊＊

Tab.3 Effects of siRNA-TMEM97 transfection on cell cycle distribution in SKOV3 cells表3 轉(zhuǎn)染siRNA-TMEM97對3組SKOV3細(xì)胞周期的影響 （n=3，%，）

Tab.3 Effects of siRNA-TMEM97 transfection on cell cycle distribution in SKOV3 cells表3 轉(zhuǎn)染siRNA-TMEM97對3組SKOV3細(xì)胞周期的影響 （n=3，%，）

組別Control組siNC組si-TMEM97組F G1 66.37±0.85 69.43±0.72 56.27±0.45ab 295.713＊＊S 21.33±1.21 19.81±0.64 18.71±0.23 8.085 G2/M 9.76±1.72 9.23±0.65 22.36±0.28ab 143.750＊＊

2.4 siRNA-TMEM97 轉(zhuǎn)染后對SKOV3 細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，si-TMEM97 組細(xì)胞的早期凋亡率相比Control 組和siNC 組顯著增高（P＜0.01），而Control組和siNC組細(xì)胞的早期凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，下調(diào)TMEM97 的表達(dá)能夠明顯促進SKOV3細(xì)胞的凋亡，見圖3、表4。

Fig.3 Effects of siRNA-TMEM97 transfection on the apoptosis of SKOV3 cells圖3 轉(zhuǎn)染siRNA-TMEM97對SKOV3細(xì)胞凋亡的影響

2.5 siRNA-TMEM97 轉(zhuǎn)染對SKOV3 細(xì)胞中凋亡及P38/MAPK 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，si-TMEM97 組細(xì)胞中Bcl-2 蛋白相對表達(dá)量較Control組和siNC組降低（P＜0.01），Bax和p-P38/MAPK蛋白相對表達(dá)量高于Control組和siNC組（P＜0.05），3 組細(xì)胞中P38/MAPK 蛋白相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4、表4。

3 討論

Fig.4 Effects of siRNA-TMEM97 transfection on the expressions of Bcl-2,Bax,p-P38/MAPK and P38/MAPK in SKOV3 cells圖4 轉(zhuǎn)染siRNA-TMEM97對SKOV3細(xì)胞中Bcl-2、Bax和p-P38/MAPK和P38/MAPK表達(dá)的影響

3.1 TMEM97 與卵巢癌 卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)致死率較高的惡性腫瘤，發(fā)病隱匿，通常局限于腹腔。目前常用的治療方法是手術(shù)聯(lián)合化療，但仍有70%～80%的復(fù)發(fā)率［6］，因此探尋有效實用的卵巢癌分子治療的新靶點、新方向迫在眉睫。TMEM97 是一種跨膜蛋白成分，其在正常結(jié)腸、胃、食管的黏膜細(xì)胞以及胰腺的腺泡腺管等組織中均有表達(dá)，但TMEM97 mRNA及蛋白在人類多種腫瘤中表達(dá)量有所差異［7］。有研究報道TMEM97在惡性腫瘤中的表達(dá)量與腫瘤發(fā)生的部位及侵襲浸潤轉(zhuǎn)移程度有關(guān)，在癌細(xì)胞與腫瘤基質(zhì)相互作用的過程中發(fā)揮著重要作用［8］。因此筆者推測TMEM97 可能在包括卵巢癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

本研究采用CCK-8 法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果表明下調(diào)TMEM97 后卵巢癌細(xì)胞SKOV3在 24、48、72 和 96 h 的增殖活力顯著低于 Control 組和siNC 組。為了進一步證實TMEM97 對卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)特性的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了下調(diào)TMEM97 的表達(dá)對SKOV3 細(xì)胞細(xì)胞周期及其凋亡的影響。結(jié)果顯示，與Control 組和siNC 組相比，TMEM97 沉默后對SKOV3 細(xì)胞具有周期阻滯效應(yīng)，SKOV3細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率有所增加。以上結(jié)果均表明，TMEM97 作為有效分子靶點之一參與了卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖和凋亡過程。

Tab.4 Effects of siRNA-TMEM97 transfection on the apoptosis and signal pathway of SKOV3 cells表4 轉(zhuǎn)染siRNA-TMEM97對3組SKOV3細(xì)胞凋亡及相關(guān)信號通路的影響 （n=3，）

Tab.4 Effects of siRNA-TMEM97 transfection on the apoptosis and signal pathway of SKOV3 cells表4 轉(zhuǎn)染siRNA-TMEM97對3組SKOV3細(xì)胞凋亡及相關(guān)信號通路的影響 （n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與siNC組比較，P＜0.05

組別Control組siNC組si-TMEM97組F凋亡率（%）2.87±0.60 2.72±0.41 5.89±0.23ab 46.550＊＊凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 0.96±0.01 0.87±0.12 0.46±0.03ab 36.014＊＊Bax 0.72±0.06 0.69±0.04 1.38±0.45ab 6.591＊P38/MAPK通路相關(guān)蛋白p-P38/MAPK 0.63±0.04 0.52±0.38 1.08±0.02ab 5.412＊P38/MAPK 0.91±0.06 0.82±0.03 0.87±0.05 2.871

3.2 TMEM97 與凋亡相關(guān)蛋白 本研究結(jié)果表明，TMEM97與卵巢癌細(xì)胞SKOV3的凋亡存在明顯調(diào)控關(guān)系，因此通過Western blot檢測了Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)水平。Bcl-2、Bax是Bcl-2家族中最多見的類凋亡相關(guān)蛋白［9］。有研究報道，Bcl-2家族蛋白可通過與線粒體及凋亡家族其他蛋白相互作用等途徑影響細(xì)胞凋亡［10］。位于細(xì)胞基質(zhì)中的Bax蛋白在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑可加速細(xì)胞色素C的釋放，從而導(dǎo)致內(nèi)源性凋亡的瀑布式啟動［11］。也有研究表明，p53腫瘤抑制因子的突變可以造成BH3結(jié)構(gòu)域中蛋白信號傳導(dǎo)受損，從而導(dǎo)致Bcl-2過表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡［12］。本研究中，抑制TMEM97表達(dá)后SKOV3凋亡明顯增加，Bcl-2表達(dá)水平下降，而Bax表達(dá)水平增高，提示在卵巢癌中下調(diào)TMEM97基因可能通過抑制Bcl-2、升高Bax蛋白表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這與Song等［13］在乳腺癌中的研究結(jié)果一致，該研究表明下調(diào)TMEM97能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

3.3 TMEM97 與 P38/MAPK 信號傳導(dǎo)通路 MAPK家族是一組重要的絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與了多種腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、炎癥反應(yīng)等［14］。本研究結(jié)果提示，si-TMEM97組卵巢癌SKOV3細(xì)胞中p-P38/MAPK 相對表達(dá)量高于 Control 組和 siNC 組，表明TMEM97對卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用可能是通過調(diào)節(jié)P38/MAPK信號通路的活性實現(xiàn)的。也有研究表明，P38/MAPK 通路與卵巢癌的關(guān)聯(lián)較多，如WASP 家族富含脯氨酸同源蛋白3（WAVE3）、野生型p53 誘導(dǎo)的磷酸酶1（WIP1）等癌基因，均可通過作用于P38/MAPK信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等惡性生物學(xué)表型［15］。為進一步驗證TMEM97對卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響是否通過調(diào)節(jié)P38/MAPK 信號通路的活性實現(xiàn)，今后實驗中將在信號通路中加入抑制劑來進行反證。

綜上所述，下調(diào)TMEM97 表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞增殖能力降低、凋亡增加，其機制可能與調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax表達(dá)及P38/MAPK信號通路的激活有關(guān)，這有望為卵巢癌的臨床治療提供新靶點和新思路。但本研究沒有涉及動物實驗，并不確定在體內(nèi)下調(diào)TMEM97 表達(dá)后對卵巢癌的調(diào)節(jié)作用，因此有待今后進行更深入的機制研究。