程凱，曹麗，張鑫艷，郝晉芳，張曉延

腸道病毒71 型（enterovirus 71，EV71）是一種單股正鏈小RNA 病毒，5 歲以下兒童感染后可以出現(xiàn)手足口?。╤and-foot-mouth disease，HFMD）［1］。該病癥狀主要有發(fā)熱、手足口皰疹，少數(shù)患兒會出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如腦膜炎、腦炎、急性弛緩性肌無力、脊髓灰質(zhì)炎、肺水腫等臨床表現(xiàn)，甚至出現(xiàn)死亡［2］。HFMD 通常在每年夏季發(fā)生，且近些年冬春季發(fā)病率也明顯上升，2008 年被列為國家法定傳染病［3］。目前國內(nèi)外學(xué)者從細(xì)胞凋亡［4］、自噬［5］、焦亡［6］等方面對EV71誘發(fā)HFMD的分子機(jī)制進(jìn)行了研究，但確切致病機(jī)制尚不明確。本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)EV71 可以引起人橫紋肌肉瘤（rhabdomyosarcoma，RD）細(xì)胞和人胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1發(fā)生自噬和凋亡［5，7］，但是這些變化的發(fā)生時間及影響因素尚缺乏明顯的證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)擬探究EV71 感染細(xì)胞后自噬和免疫應(yīng)答相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生改變的時間和具體靶點(diǎn)，以期為HFMD的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和病毒株 RD 細(xì)胞株購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，EV71 型病毒株由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所趙振東教授課題組惠贈。

1.1.2 試劑及儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，兔源一抗微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（LC-3）、自噬相關(guān)基因5（Atg5）、病毒衣殼蛋白1（VP-1）購自CST公司，鼠源一抗雷帕霉素不敏感的mTOR伴侶蛋白（Rictor）購自GeneTex公司，兔源一抗β-actin 購自沈陽萬類生物科技有限公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAG）配制試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，總RNA 提取試劑（TRIzol）購自Invitrogen公司，其他試劑均選自國內(nèi)公司的分析純。3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher 公司，Eon 微孔板酶標(biāo)儀購自美國BioTek 公司，DMI3000B 倒置熒光顯微鏡購自德國Leica 公司，垂直電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、Universal Hood Ⅲ凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RD 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 mg/L 鏈霉素和100 U/mL 青霉素）中，37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每2 d 細(xì)胞換液1 次，長滿培養(yǎng)皿后傳代。

1.2.2 病毒擴(kuò)增 RD細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度約90%，提前1 h換液，-80 ℃冰箱取出EV71病毒液，按1∶5加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，十字混勻，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡下觀察染毒細(xì)胞全部死亡后，收集上清于15 mL 離心管，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，上清分裝標(biāo)記并凍存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 病毒滴度測定 取生長狀態(tài)良好的RD細(xì)胞，計數(shù)，接種至 96 孔板，每孔100 μL，含 5 000 個細(xì)胞。按10 倍倍比稀釋病毒，每個濃度加1列，共11列，第12列加等量培養(yǎng)基作陰性對照。培養(yǎng)48 h后標(biāo)記50%以上細(xì)胞致死的孔，按公式計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（50%tissue culture infective dose，TCID50），按照卡波公式計算并換算感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）。

1.2.4 不同時間和劑量病毒對細(xì)胞的作用 RD細(xì)胞接種至6 孔板，按 MOI=10、MOI=1、MOI=0.1 給各孔加病毒液，培養(yǎng)12 h 后收集細(xì)胞，提取總蛋白。通過蛋白免疫印跡（Western blot）技術(shù)觀察VP-1 的表達(dá)量，并分析篩選合適的MOI。根據(jù)篩選結(jié)果以MOI=1 感染細(xì)胞，選擇0、0.5、1、1.5、3、6、9、12 h共8組，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量變化。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入含苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的蛋白裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min離心15 min，BCA試劑盒測總蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE分離蛋白約2 h，轉(zhuǎn)硝酸纖維素（NC）膜1 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗孵育4 ℃過夜。次日清洗3 次，用HRP 標(biāo)記的二抗孵育2 h，加底物顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析結(jié)果。

1.2.6 總mRNA提取及測序 同1.2.4處理并收集細(xì)胞，分別加TRIzol，吹打均勻，經(jīng)干冰運(yùn)輸至華大基因公司武漢公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。提取出的RNA 經(jīng)檢測合格后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。末端連接接頭，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物熱變性成單鏈，建立單鏈環(huán)狀DNA文庫，CG測序儀測序。

1.2.7 高內(nèi)涵細(xì)胞成像檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 提前1 d細(xì)胞換液并計數(shù)，將RD 細(xì)胞接種至96 孔板，每組設(shè)3 個復(fù)孔，按照MOI=1 選擇不同時間進(jìn)行干預(yù)。干預(yù)后吸凈培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定30 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后用0.5%Triton-X100室溫通透20 min，山羊血清封閉30 min。根據(jù)測序結(jié)果各孔按1∶5 000濃度比加適量Atg5、Rictor抗體，4 ℃過夜。次日PBS清洗后加熒光二抗，室溫避光孵育1 h，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染細(xì)胞核10 min，PBS 清洗后上機(jī)檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 測序數(shù)據(jù)運(yùn)用GO、KEGG 等軟件進(jìn)行分析，其他數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EV71 感染對RD 細(xì)胞形態(tài)和功能變化的影響 倒置顯微鏡明場觀察可見，培養(yǎng)中的RD細(xì)胞在接觸EV71后0.5 h即可出現(xiàn)明顯的空斑，3 h細(xì)胞由梭形貼壁生長逐漸變?yōu)閳A形懸浮，與0 h組相比細(xì)胞數(shù)量明顯減少（F=193.330，P＜0.05）。9 h 圓形細(xì)胞約占總數(shù)的50%，12 h約占70%，提示病毒已經(jīng)開始大量繁殖和釋放，細(xì)胞死亡；而正常培養(yǎng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好，仍然維持梭形貼壁生長。見圖1。

2.2 不同劑量和時間EV71 感染RD 細(xì)胞對蛋白表達(dá)的影響 EV71 感染RD 細(xì)胞12 h 后，病毒已經(jīng)在細(xì)胞內(nèi)有所復(fù)制，VP-1 表達(dá)量隨MOI 增加而升高（F=7.133，P＜0.05），見圖2A、B。MOI=1 時已經(jīng)可以看到明顯的VP-1 條帶，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)全部選擇MOI=1進(jìn)行細(xì)胞感染。在MOI=1時病毒感染后6 h、9 h、12 h，病毒在RD 細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)開始表達(dá)VP-1，細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)合成新的病毒，但3個時點(diǎn)間VP-1的表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.201，P＞0.05），見圖2C、D；而細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ的變化出現(xiàn)在感染后9 h，高于0 h 組（F=12.005，P＜0.01），見圖2E、F。

Fig.1 Morphological and quantitative changes of RD cells infected with EV71 at different time points圖1 不同時間EV71感染RD細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量變化

Fig.2 Effects of different doses and time points of EV71 on protein expression in RD cells圖2 不同劑量和時間EV71對RD細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

2.3 EV71 感染RD 細(xì)胞對基因表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，EV71 感染RD 細(xì)胞后0.5 h，細(xì)胞內(nèi)上調(diào)基因294 個，下調(diào)基因34 個（圖3A），感染后1 h 上調(diào)基因 29 個，下調(diào)基因 52 個（圖 3B），1.5 h 上調(diào)基因707 個，下調(diào)基因 72 個（圖 3C）?；虮磉_(dá)變化峰值出現(xiàn)在感染后3 h（圖3D），上調(diào)基因1 199 個，下調(diào)基因126 個。在感染后6 h、9 h、12 h 基因表達(dá)變化略有下降，分別上調(diào)基因403、747、758 個，下調(diào)基因472、184、169 個（圖3E～G）。感染病毒0.5 h 后已經(jīng)有病毒侵入細(xì)胞，而3 h 病毒已經(jīng)開始通過影響細(xì)胞基因表達(dá)而啟動病毒復(fù)制。

2.4 EV71 感染RD 細(xì)胞對信號通路分子的影響 通過GO 富集和KEGG 信號通路分析發(fā)現(xiàn)，在EV71 感染RD 細(xì)胞3 h，細(xì)胞信號通路基因有216個發(fā)生變化（綠色），其中100 多個信號分子均參與細(xì)胞的自噬或凋亡。在組織系統(tǒng)相關(guān)基因中，內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)基因表達(dá)上調(diào)也比較明顯（黃色），這與臨床上常見的癥狀相吻合。見圖4。

2.5 EV71 感染RD 細(xì)胞對自噬蛋白的影響 高內(nèi)涵細(xì)胞成像結(jié)果顯示，RD細(xì)胞在感染后細(xì)胞數(shù)量明顯減少，病毒感染引起細(xì)胞產(chǎn)生病變和死亡。但細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度明顯增加，隨著病毒進(jìn)入細(xì)胞，引起細(xì)胞內(nèi)自噬蛋白Atg5（F=3.719，P＜0.05）、Rictor（F=3.588，P＜0.05）表達(dá)上調(diào)，見圖5。

Fig.3 Gene expression changes at different time points of virus intervention圖3 病毒干預(yù)不同時間點(diǎn)的基因表達(dá)變化

Fig.4 The GO enrichment and KEGG pathway analysis of differential expressed genes of RD cells 3 h after infection with EV71圖4 GO富集和KEGG信號通路分析EV71感染RD細(xì)胞3 h后基因差異表達(dá)

3 討論

3.1 EV71感染RD細(xì)胞6 h即出現(xiàn)病毒復(fù)制 結(jié)果顯示，RD細(xì)胞在感染EV71后0.5 h即可見細(xì)胞狀態(tài)變差，空斑形成增多；3 h細(xì)胞數(shù)量明顯下降，說明此時病毒開始在細(xì)胞內(nèi)完成RNA 復(fù)制，蛋白質(zhì)合成、包裝和釋放。Western blot 結(jié)果顯示，細(xì)胞在病毒感染后6 h才能翻譯出結(jié)構(gòu)蛋白VP-1。病毒感染細(xì)胞后病毒RNA釋放進(jìn)入被感染細(xì)胞、RNA復(fù)制負(fù)鏈互補(bǔ)RNA、翻譯多聚蛋白質(zhì)、剪切成4 個結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～4）和7 個非結(jié)構(gòu)蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）［8-9］，包裝病毒顆粒并釋放。在此過程中，宿主細(xì)胞可以通過抑制自噬來增強(qiáng)病毒的復(fù)制［3］，但是也可能是通過增強(qiáng)自噬實(shí)現(xiàn)對宿主細(xì)胞的免疫逃逸［5］。

Fig.5 High content screening showed protein expression after virus infection圖5 高內(nèi)涵成像顯示病毒感染后蛋白表達(dá)情況

3.2 EV71 感染RD 細(xì)胞3 h 出現(xiàn)信號通路分子變化 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，病毒感染后基因表達(dá)變化的峰值出現(xiàn)在3 h，上調(diào)基因1 199個，說明該時點(diǎn)是病毒復(fù)制和包裝的關(guān)鍵點(diǎn)。上調(diào)的基因中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)216 個，其中大多數(shù)與自噬和凋亡有關(guān)。Shi等［10］證明EV71 通過引起宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡進(jìn)而引起病毒的釋放。Yeganeh 等［11］認(rèn)為 EV71 通過增強(qiáng)宿主細(xì)胞的自噬而引起免疫逃逸。為了明確自噬信號通路與病毒復(fù)制的關(guān)系，本研究進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)。

3.3 EV71 感染RD 細(xì)胞通過自噬信號分子產(chǎn)生免疫應(yīng)答 KEGG 信號通路富集分析顯示，在病毒感染后3 h，與自噬相關(guān)的多個信號分子被激活，高內(nèi)涵細(xì)胞成像結(jié)果也證實(shí)在感染后9 h 自噬蛋白Atg5和mTOR 伴侶蛋白Rictor 的表達(dá)上升。mTOR 通路是經(jīng)典的自噬信號通路，與細(xì)胞內(nèi)代謝調(diào)控相關(guān)，主要受胰島素的激活，對機(jī)體能量代謝有重要的調(diào)節(jié)作用［12］。抑制mTOR 信號通路可以增強(qiáng)細(xì)胞自噬，是一種饑餓狀態(tài)下細(xì)胞調(diào)節(jié)能量代謝的重要方式，病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬同時也可以引起mTOR通路的激活［13］。EV71在進(jìn)入RD細(xì)胞后激活mTOR信號分子，增強(qiáng)細(xì)胞自噬，有助于細(xì)胞清除病毒，但病毒也可能通過激活細(xì)胞自噬產(chǎn)生對機(jī)體的免疫逃逸作用，有利于病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制與釋放。

綜上所述，EV71 感染后3 h 激活宿主細(xì)胞自噬信號通路，6 h 病毒衣殼蛋白合成，開始組裝新的病毒，12 h宿主細(xì)胞自噬達(dá)峰值，新病毒釋放。這種病毒感染過程與細(xì)胞自噬有可能是病毒免疫逃逸的一種機(jī)制，筆者會持續(xù)關(guān)注EV71感染后細(xì)胞自噬分子時間和空間的變化，以期發(fā)現(xiàn)EV71感染細(xì)胞后引起免疫應(yīng)答的確切機(jī)制。