劉得水 周建文 程昊 趙詩瑤 李洋 張英華 徐廣有

摘 ?要：目的 ?本研究探討氯喹對肝癌細(xì)胞在低氧環(huán)境下的增殖和侵襲的影響及其潛在的作用機制。方法 ?取肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞分成空白對照組，陰性對照組，和氯喹干預(yù)組，采用qPCR檢測氯喹在肝癌細(xì)胞HepG2以及正常肝組織上皮細(xì)胞SMMC-7721中氯喹的表達(dá)水平。用氯喹處理HepG2細(xì)胞;通過MTS微量酶反應(yīng)比色法、流式細(xì)胞術(shù)、western blot，葡萄糖和乳酸檢測分析試劑盒，檢測給予氯喹刺激后對HepG2的增殖、侵襲的影響、以及其對Wntβ-catenin通路表達(dá)的影響。結(jié)果 ?與空白對照組相比，氯喹組的HepG2遷移能力顯著降低（P<0.05），氯喹組總凋亡率為35.5%，對照組總凋亡率為13.4%，氯喹組總凋亡率顯著升高（P<0.05）。氯喹組OD 520值為（8.51±0.45），對照組為（2.97±0.33），氯喹組細(xì)胞侵襲能力降低（P<0.05）。Wntβ-catenin通路的相關(guān)蛋白表達(dá)降低。結(jié)論 ?氯喹可通過調(diào)控Wntβ-catenin通路表達(dá)，調(diào)控HepG2細(xì)胞增殖，凋亡及侵襲能力。

關(guān)鍵詞：肝癌;氯喹;增殖;Wntβ-catenin通路

中圖分類號：R735.7 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ?文章編號：1009-8011（2020）-11-0039-03

肝癌是我國發(fā)病率非常高的分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，易復(fù)發(fā)，5年生存率極低。目前迫切需要找到新的分子靶點和治療策略來遏制肝癌發(fā)展惡化[1-3]。氯喹是一種抗瘧原蟲藥，其作用機制在于本品與核蛋白有較強的結(jié)合力，插入到DNA的雙螺旋兩股之間，可與DNA形成復(fù)合物，從而阻止DNA的復(fù)制與RNA的轉(zhuǎn)錄[4-5]。目前腫瘤細(xì)胞代謝方面的研究已成為當(dāng)今腫瘤研究的熱點。本研究將通過分子實驗預(yù)測氯喹對肝癌細(xì)胞增殖與分化以及糖代謝的影響，為臨床診治提供新靶標(biāo)。

1 ?材料與方法

1.1 ?細(xì)胞培養(yǎng)

肝癌HepG2（ATCC○ CRL-1420TM）細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，正常肝組織上皮細(xì)胞SMMC-7721（由廣州燁善生物科技有限公司提供）用10%FBS（Hyclone，USA）、DMEM（Gibco Corporation，USA）培養(yǎng)于37℃、5%C02潮濕大氣細(xì)胞培養(yǎng)箱中。將實驗分為三組：空白對照組，陰性對照組，氯喹干預(yù)組。

1.2 ?氯喹濃度及給藥方式

從湖北邦盛化工有限公司購入氯喹100g。按照說明書以5mg/mL劑量將氯喹加入HepG2細(xì)胞氯喹干預(yù)組中。

1.3 ?Western blot法檢測蛋白表達(dá)

利用細(xì)胞裂解液將蛋白從細(xì)胞中提出，12000rpm離心15min，用雙氰胺酸（BCA）法測定蛋白濃度，使用含有聚丙烯酰胺凝膠的SDS電泳分離蛋白質(zhì)樣品，將分離的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。用5%牛血清白蛋白在TBST緩沖液中阻斷2h后，用抗體在4℃孵育過夜。用TBST緩沖液沖洗3次10min，用相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二級抗體在室溫下孵育2h，再用TBST緩沖液沖洗3次。用化學(xué)發(fā)光HRP底物增強化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)對印跡信號進(jìn)行可視化。檢測beclin-l，LCI，LC-llc-myc，cyclin D1 klotho，β-tublin，lamin BI表達(dá)。

1.4 ?MTS法檢測細(xì)胞增殖

將細(xì)胞接種到96孔板中，濃度為1×103個細(xì)胞/孔，貼壁過夜。每24h，20μL溶液試劑添加到每孔中，使用酶聯(lián)免疫吸附測定儀（BioTek，VT，美國）在37℃孵育3h后，酶標(biāo)儀讀板，MTS檢測讀取OD490數(shù)據(jù)根據(jù)以下公式計算存活率：存活率=[（實驗組吸光度-空白組吸光度）/（對照組吸光度-空白組吸光度）]×100%。

1.5 ?流式檢測細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞培養(yǎng)板各組的培養(yǎng)基分別轉(zhuǎn)移到15mL的錐形管中并置于冰上。利用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來、PBS洗滌后48h收集細(xì)胞，用Annexin V凋亡檢測試劑盒FITC（E.BioSoCion，圣地亞哥，CA92121美國）在室溫下用V-FITC和碘化丙啶染色。用流式細(xì)胞儀（BD Biosciences，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ）進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1.6 ?Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力

用胰蛋白酶/EDTA法檢測HEPG2細(xì)胞的遷移和侵襲。將所有細(xì)胞（1.5×105）置于transwell chambers（Corning Incorporated，USA）中進(jìn)行遷移測定，并將1×104細(xì)胞置于涂有150mg基質(zhì)凝膠的上腔室中進(jìn)行侵襲測定。下腔注入含10%FBS的DMEM。在37℃下孵育12～24h后，移走細(xì)胞膜上表面的細(xì)胞。膜下表面的細(xì)胞被水晶紫固定和染色。在光鏡下觀察和計數(shù)染色細(xì)胞。

1.7 ?統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗均至少重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)用（x±s）表示，采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。3組蛋白表達(dá)水平，細(xì)胞存活率，相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較用單因素方差分析，以P<0.05代表差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?MTS檢測細(xì)胞活力

在給予氯喹后，使用MTS法對不同時間點（0h、24h、48h和72h）的肝癌HepG2細(xì)胞活力進(jìn)行檢測。與對照組相比，氯喹組在48h和72h能夠顯著性抑制細(xì)胞活力（t=4.454，P<0.05）并且細(xì)胞增殖明顯降低（t=7.823，P<0.05）。見圖1。

2.2 ?給予氯喹對HepG2細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，給予氯喹后HepG2細(xì)胞凋亡明顯，氯喹組總凋亡率為35.5%，而對照組總凋亡率為13.4%，氯喹組總凋亡率顯著升高（χ2=22.353，P<0.05）氯喹組早期凋亡，晚期凋亡和總凋亡細(xì)胞數(shù)都較對照組顯著增加（P<0.05）。見圖2A-G。

Transwell檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，氯喹組OD 520值為（8.51±0.45），對照組為（2.97±0.33），氯喹組細(xì)胞侵襲能力降低（P<0.05）。氯喹組可抑制HepG2細(xì)胞的侵襲能力，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖3A-B。

2.4 ?HepG2 細(xì)胞中Wntβ-catenin通路中相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與對照組相比，氯喹組Koho，B-catenin，表達(dá)上升，C-myc和Cyclin DI I的蛋白表達(dá)明顯下降，說明氯喹組的Wntβ-catenin被明顯抑制。見圖4。

3 ?討論

對于大多數(shù)腫瘤細(xì)胞來說，癌基因的突變起到十分關(guān)鍵的促進(jìn)作用[6]。惡性腫瘤的發(fā)生與蛋白質(zhì)靶點的突變和異常相關(guān)，氯喹可作為放化療增敏劑提高抗癌療效，抑制細(xì)胞生長、分化并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，特別是其能夠抑制自噬的功能在腫瘤治療中具有重要作用。因為自噬在腫瘤生長過程中的角色會隨著疾病的病程變化而不斷產(chǎn)生動態(tài)變化，與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，因此氯喹的自噬抑制作用有望為腫瘤治療提供一種新方法。

本研究中，氯喹可以明顯降低低氧環(huán)境下抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。表明氯喹對肝癌細(xì)胞系具有一定的抗腫瘤活性。有研究報道[6]，自然產(chǎn)生的氯喹是一種Taq DNA聚合酶抑制劑，并可以在體外抑制肝癌的進(jìn)展，這從側(cè)面印證本研究結(jié)果[7]。本研究表明，氯喹組總凋亡率為35.5%，而對照組總凋亡率為13.4%，氯喹組總凋亡率顯著升高，結(jié)合功能實驗證實，氯喹的表達(dá)可以明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，機制通路實驗表明，氯喹很可能是通過調(diào)節(jié)有關(guān)Wntβ-catenin通路的相關(guān)來調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。此外，有研究表明，氯喹誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡依賴于p53，抑制p53通路可使腫瘤細(xì)胞增值率降低百分之46.65%。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，氯喹也能夠誘導(dǎo)Wntβ-catenin表達(dá)缺失，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的凋亡，初步提示氯喹誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞死亡可能與p53的作用無關(guān)，但仍需進(jìn)一步證明[8]。

綜上所述，本研究通過功能實驗證實，氯喹可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖。揭示氯喹有可能成為肝癌治療的有效靶點，但更具體的分子機制和靶向肝癌治療效果，有待今后進(jìn)一步深入的分子通路和動物實驗來證實。

參考文獻(xiàn)

[1]朱云，李成，林鑫盛，等.白術(shù)多糖對肝癌細(xì)胞增殖及侵襲的抑制作用及其機制[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2019，39（10）：1180-1185.

[2]全柳霞，吳立然，李晶.Axin2基因?qū)Ω伟┘?xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)分子表達(dá)的調(diào)控及機制[J].中國生物制品學(xué)雜志，2019，32（5）：512-516.

[3]Li X， Wang Y， Yan B， et al. Knockdown of STAT3 inhibits proliferation and migration of HepG2 hepatoma cells induced by IFN1[J].Chinese Journal of Cellular & Molecular Immunology，2018，34（2）：115-122.

[4]黃健，黃海欣，黃東寧，等.miR-144-3p通過靶向FZD4阻斷Wnt/β-catenin通路抑制肝癌Huh-7細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[J].中國腫瘤生物治療雜志，2019，26（10）：1101-1106.

[5]馮桂銀，張庚，王海倫，等.SOX7基因?qū)Ω伟┘?xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及Wnt/β-catenin信號通路的影響[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2019，44（7）：846-849.

[6]彭寧，李綿靖，蘭超智，等.長鏈非編碼RNA ZNF674-AS1通過Wnt信號通路調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖與凋亡[J].中華實驗外科雜志，2019，36（2）：308-311.

[7]廖思夢，齊鳴，顏佳夢，等.氯喹抑制自噬對嘔吐毒素誘導(dǎo)的仔豬生長性能和血液指標(biāo)變化的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2019，31（10）： 4817-4824.

[8]Maclean KH， Dorsey FC， Cleveland JL， et al. Targeting lysosomal degradation induces p53-dependent cell death and prevents cancer in mouse models of lymphomagenesis[J]. Journal of Clinical Investigation，2008，118（1）：79-88.