馬曉菲，陳曉勇，劉愛菊，韓紅葉，孫歡，李清艷，敦偉濤，孫樹春，4，田樹軍，4*

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，河北 保定 071000；2. 河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北 保定 071000；3. 河北農(nóng)業(yè)大學科教興農(nóng)中心，河北 保定 071000；4. 河北省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000)

1994年在澳大利亞布魯拉美利奴羊群基因組中發(fā)現(xiàn)了與多胎性狀相關(guān)的FecB基因(fecundity booroola，F(xiàn)eeB)[1]，并通過進一步的克隆定位發(fā)現(xiàn)其所處區(qū)域同人的四號染色體上的骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IB(bone moorphogenetic IB,BMPR-IB)基因所處區(qū)域相同[2]。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，BMPR-IB基因高度保守的胞內(nèi)激酶信號區(qū)域的第746位堿基處發(fā)生了A→G突變，即FecB突變，此突變引起基因所編碼蛋白由谷氨酰胺變?yōu)榫彼?，導致BMPR-IB受體部分失活，使其天然配體生長分化因子5(growth differentiation 5,GDF-5)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic 4,BMP-4)對顆粒細胞類固醇分泌的抑制作用下降，從而使顆粒細胞分化加快，排卵數(shù)增多。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMPs)是來自轉(zhuǎn)化生長因子β超家族(transforming growth factor beta superfamily,TGFβs)中的一類多肽蛋白。BMPs的受體屬于TGFβ受體超家族的成員，是一種具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)的膜蛋白受體，分為細胞外區(qū)、細胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)[3]。目前發(fā)現(xiàn)的Ⅰ型受體和Ⅱ型受體都參與BMPs信號的傳導[4]。當BMPs、Ⅰ型受體與Ⅱ型受體形成復(fù)合物后，Ⅱ受體自身首先激活，然后進一步激活Ⅰ型受體的磷酸化；一旦Ⅰ型受體活化后，胞質(zhì)中游離的受體調(diào)節(jié)Smads(receptor-activated smad,R-Smad)便向I型受體移動并激活磷酸化[5]。激活后的R-Smads從受體復(fù)合物上脫離后，迅速與共介導Smads(common mediator smad,Co-Smad)形成異源復(fù)合物，進行移位入核，與靶基因啟動子中的特定序列結(jié)合從而起到調(diào)控的作用[9]。

為了更好地了解BMPR-IB基因與綿羊多胎性狀的相關(guān)性，國內(nèi)學者對不同品種綿羊和山羊進行了研究。研究結(jié)果表明，以一胎產(chǎn)多羔著稱的湖羊為BB型，肉用中國美利奴具有BB、B+、++3種基因型，夏洛萊、陶賽特、薩?？?、中國美利奴則僅有++基因型[6]；小尾寒羊中發(fā)現(xiàn)了B基因的存在[7]，并證實B基因確實能提高小尾寒羊的胎產(chǎn)羔數(shù)[8]；濟寧青山羊以高的胎產(chǎn)羔數(shù)而馳名，也發(fā)現(xiàn)了BMPR-IB外顯子區(qū)域816 bp處發(fā)生了A→G突變，相應(yīng)的蛋白質(zhì)由谷氨酰胺變?yōu)榫彼醄9]。寒泊羊是以杜泊羊為父本，以小尾寒羊為母本，通過雜交、橫交固定、自群繁育等育種過程，歷經(jīng)十余年而培育出的一個肉用綿羊新種群，目前主要分布于河北省部分地區(qū)，其生長速度、育肥效果及羊肉品質(zhì)均優(yōu)于小尾寒羊[10-11]。然而，目前寒泊羊的胎產(chǎn)羔數(shù)卻低于小尾寒羊，這在一定程度上限制了寒泊羊中試推廣羊只數(shù)量的增加及中試范圍的進一步擴大。

為此，本文開展了寒泊羊種群中BMPR-IB基因多態(tài)性及其對胎產(chǎn)羔數(shù)影響的研究，旨在探討用B基因作為提高寒泊羊胎產(chǎn)羔數(shù)性能及其標記基因的可行性，為今后寒泊羊的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和試劑

1.1.1 試驗動物

選擇寒泊羊育種核心群的584只個體進行采血。

1.1.2 主要試驗試劑

血液基因組柱式小量提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)、2XES Taq MasterMix(北京康為世紀生物科技有限公司)、Sangon Biotech生工引物(上游引物：5′-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3′ 下游引物：5′-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3′)、AVaII酶。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

將新鮮血樣加入檸檬酸鈉抗凝劑放入4 ℃冰箱進行保存(長時間放置應(yīng)放入-20 ℃保存)。使用血液基因組柱式小量提取試劑盒進行DNA的提取。提取出DNA置于-20 ℃保存。

1.2.2 PCR擴增與產(chǎn)物檢測

PCR體系反應(yīng)(25 μL):Mix 10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、ddH2O 13.2 μL、模板DNA 1 μL。使用1%的瓊脂糖凝膠對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳抽檢，其中電泳電壓為80 V，電流強度為200 mA,時間為30 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的酶切與RFLP分析

酶切體系：總體積10 μL。Buffer 1 μL、PCR產(chǎn)物3 μL、AVaII 1 μL、ddH2O 5 μL。反應(yīng)體系：37 ℃水浴消化30 min，反應(yīng)完畢進行電泳檢測。使用3%的瓊脂糖凝膠對酶切產(chǎn)物進行電泳，凝膠成像。其中電泳電壓為120 V，電流強度為200 mA,時間為30 min。

1.2.4 判定基因型

根據(jù)酶切與RFLP分析結(jié)果，判定寒泊羊個體的基因型，并調(diào)取寒泊母羊的個體產(chǎn)羔記錄，分析寒泊羊種群中BMPR-IB基因的多態(tài)性及其對胎產(chǎn)羔數(shù)的影響效果。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用EXCEL軟件整理數(shù)據(jù)，計算FecB基因的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)、雜合度(heterozygosity，He)、有效等位基因數(shù)(effective number of allele，Ne)，并進行Hardy-weinberg平衡檢驗；建立線性模型：Yijk=u+Pi+Gj+eijk，其中Yijk為產(chǎn)羔數(shù)記錄值，u為群體均值，Pi為第i個胎次的固定效應(yīng)，Gj為第j種BMPR-IB基因型的固定效應(yīng)，eijk為隨機殘差效應(yīng)。使用SPSS軟件中的一般線性模型進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

FecB基因片段大小為140 bp，電泳結(jié)果如圖1所示，其PCR擴增產(chǎn)物的電泳條帶清晰，與目的基因大小一致，表明PCR擴增產(chǎn)物質(zhì)量較好。

M. DL800 bp Marker; 1. FecB基因擴增片段圖1 BMPR-IB基因PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，酶切產(chǎn)物的電泳條帶清晰。BB基因型僅在110 bp處有一條帶；B+基因型有2條帶，分別在110 bp和140 bp處；++基因型(野生型)僅在140 bp條處有1條帶。

2.3 寒泊羊種群的胎產(chǎn)羔性能

對具有產(chǎn)羔記錄的998只次繁殖母羊的胎產(chǎn)羔數(shù)進行統(tǒng)計，寒泊母羊胎產(chǎn)羔分布情況如表1所示，胎產(chǎn)1羔的比例較高為48.5%，胎產(chǎn)3羔及以上的比例較低為13.62%。

表1 寒泊母羊胎產(chǎn)羔分布情況

2.4 BMPR-IB基因多態(tài)性及群體遺傳學分析

根據(jù)酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果，各基因型頻率分布情況如表2所示。BMPR-IB基因在寒泊羊群體中有BB、B+和++3種基因類型，其基因型頻率以B基因和+的基因頻率較高，分別為33.33%和66.67%。

表2 基因型頻率分布

BMPR-IB基因在寒泊羊群體中屬于中度多態(tài)(0.25

表3 FecB基因在寒泊羊群體中的群體遺傳學分析

2.5 BMPR-IB基因型對胎產(chǎn)羔數(shù)的影響

對基因型明確母羊的胎產(chǎn)羔數(shù)情況進行統(tǒng)計，結(jié)果如表4所示。無論初產(chǎn)母羊還是經(jīng)產(chǎn)田羊，BB和B+基因型的平均胎產(chǎn)羔數(shù)均高于++基因型；對于所有胎次的產(chǎn)羔數(shù)進行統(tǒng)計，BB和B+基因型的平均胎產(chǎn)羔數(shù)分別為2.04只和1.93只，++基因型的平均胎產(chǎn)羔數(shù)為1.44只。

表4 不同基因型平均胎產(chǎn)羔數(shù)

對各變量之間的相關(guān)性進行分析,結(jié)果如表5所示。胎次與產(chǎn)羔數(shù)在0.05水平上顯著相關(guān)(Sig.<0.05)，且呈正相關(guān)；母羊所攜帶的B基因的數(shù)量與產(chǎn)羔數(shù)在0.05水平上顯著相關(guān)(Sig.<0.05)，且呈相關(guān)。而胎次與母羊所攜帶的B基因數(shù)量之間并無顯著的相關(guān)性(Sig.>0.05)。通過以上相關(guān)性分析可知，隨著母羊胎次以及攜帶的B基因數(shù)量的增加，其產(chǎn)羔數(shù)也隨之增加。

表5 相關(guān)性分析

以胎產(chǎn)羔數(shù)為因變量，攜帶B基因數(shù)以及胎次為自變量，使用SPSS軟件建立多元線性回歸模型，模型擬合情況如表6所示。運用F檢驗法，在顯著水平0.05情況下，線性關(guān)系顯著(Sig.<0.05)。從相關(guān)系數(shù)進行檢驗，R為0.34，擬合優(yōu)度中等。綜上，模型的擬合效果較好。

表6 方差分析

經(jīng)過擬合度檢驗之后，進一步得到多元線性回歸系數(shù)列表，如表7所示。根據(jù)對應(yīng)的系數(shù)得到模型預(yù)測方程：胎產(chǎn)羔數(shù)=0.415×攜帶B基因數(shù)量+0.320×胎次+0.978。根據(jù)容差和VIF進行共線性判斷可知，模型的共線性不明顯(VIF<20)。

表7 多元線性回歸系數(shù)

對建立的模型殘差統(tǒng)計量進行分析，其頻率分布直方圖和標準正態(tài)P-P圖如圖3和圖4所示。由圖可以看出，模型的標準化殘差基本呈正態(tài)分布，散點分布也較為靠近直線，具有較好的方差齊性和正態(tài)性。

圖3 回歸模型回歸標準化殘差的直方圖

圖4 回歸標準化的正態(tài)P-P圖

3 討論

3.1 寒泊羊的胎產(chǎn)羔性能

國內(nèi)目前缺乏專用的肉用綿羊新品種，地方品種的產(chǎn)肉性能普遍劣于國外的肉用品種。從國外引進肉羊品種與地方品種進行雜交改良，成本高，其后代產(chǎn)羔率低，對粗放的飼養(yǎng)條件也不能很好適應(yīng)，而且雜交體系較為復(fù)雜，在實際生產(chǎn)中易發(fā)生亂配現(xiàn)象從而丟失優(yōu)秀性狀。因此，培育符合國情和農(nóng)區(qū)養(yǎng)殖現(xiàn)狀的肉用新品種刻不容緩。小尾寒羊繁殖性能優(yōu)越，杜泊羊產(chǎn)肉性能好，寒泊羊是以小尾寒羊為母本，杜泊羊為父本進行培育，旨在培育兼顧肉用性能和繁殖性能的肉用綿羊品種。近十余年，以多胎基因BMPR-IB作為分子標記進行選育，目的是提高其產(chǎn)羔數(shù)，同時對體型外貌進行嚴格篩選，目的是維持較好的產(chǎn)肉性能。有研究表明，寒泊羊的早期增重顯著好于小尾寒羊, 肉用體型較小尾寒羊顯著改善[12]，其繁殖性能較杜泊羊也有所改良，能夠常年發(fā)情配種產(chǎn)羔[13]。對寒泊母羊歷年胎產(chǎn)羔數(shù)記錄進行統(tǒng)計，其胎產(chǎn)羔率平均為168%。雖高于杜泊綿羊平均產(chǎn)羔率(136%)，但仍與小尾寒羊胎產(chǎn)羔率(260%)具有較大的差距。本研究對具有產(chǎn)羔記錄的998只繁殖母羊的胎產(chǎn)羔數(shù)進行統(tǒng)計，胎產(chǎn)1羔的比例為48.5%，胎產(chǎn)2羔的比例為37.88%，胎產(chǎn)3羔及以上的比例為13.62%，可見目前寒泊羊種群的胎產(chǎn)羔率在個體間存在較大差異，有希望通過增加選擇強度的途徑來提升胎產(chǎn)羔數(shù)及整齊度。

為了滿足肉羊集約化舍飼對繁殖母羊胎產(chǎn)羔數(shù)不低于2只并且胎產(chǎn)羔數(shù)量整齊一致的要求，因此如何有效提升母羊的胎產(chǎn)羔數(shù)并縮小寒泊羊胎產(chǎn)率這一繁殖技術(shù)指標的變異系數(shù)，將成為下一步進行寒泊羊品種選育亟待解決的問題。

3.2 寒泊羊群體中BMPR-IB基因的多態(tài)性及群體遺傳性分析

BMPR-IB基因作為多胎性狀的主效基因,在許多繁殖性能較為優(yōu)秀的品種中都已被發(fā)現(xiàn)。湖羊作為中國特有的多胎品種全為BB型，具有多胎性能的小尾寒羊中也發(fā)現(xiàn)了突變型(B基因)的存在，以高的胎產(chǎn)羔數(shù)而馳名的濟寧青山羊也發(fā)現(xiàn)了BMPR-IB外顯子區(qū)域816 bp處發(fā)生了A→G突變[9]。肉用中國美利奴具有BB、B+、++3種基因型，夏洛萊、陶賽特、薩福克、中國美利奴則僅有++基因型[6]。可見，BMPR-IB基因的多態(tài)性在不同羊品種間存在較大差異。本研究結(jié)果顯示，BMPR-IB基因在寒泊羊群體中有BB、B+和++3種基因類型，其基因型頻率分別為16.66%、33.34%和50.00%。據(jù)此計算，B和+兩種基因在寒泊羊種群中的基因頻率目前分別為33.33%和66.67%，B基因較+基因的頻率明顯處于偏低水平。

BMPR-IB基因在寒泊羊群體中處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)，屬于中度多態(tài)，說明人工以FecB基因為分子標記對寒泊羊進行選育有一定效果。有效等位基因數(shù)達到1.8，較為接近等位基因數(shù)的絕對值，雜合度0.44較低，說明人工選擇壓力較大。綜上數(shù)據(jù)說明，多年的選育確實提高了B基因的概率，但目前B基因的概率仍處于偏低水平，需進一步加強選擇強度。

3.3 BMPR-IB基因型對胎產(chǎn)羔數(shù)的影響

BMPR-IB基因高度保守的胞內(nèi)激酶信號區(qū)域A746G突變，引起細胞內(nèi)激酶區(qū)域的編碼蛋白由谷氨酰胺變?yōu)榫彼?，導致BMPR-IB部分失活，使其天然配體抑制顆粒細胞類固醇分泌的作用下降，類固醇濃度上升加速了顆粒細胞分化，從而促進了排卵，有利于提高胎產(chǎn)羔數(shù)。近年來，許多學者通過對攜帶FecB基因的高繁殖力母羊進行代謝機制和分子機制的研究發(fā)現(xiàn)，攜帶FecB基因的母羊允許較小的卵泡在促性腺激素分泌抑制期間存活，即更多的卵泡可發(fā)育成排卵卵泡[14]，從而顯著提高排卵數(shù)。本研究通過對繁殖母羊的胎產(chǎn)羔數(shù)進行統(tǒng)計也發(fā)現(xiàn)，B基因?qū)μギa(chǎn)羔數(shù)具有正效應(yīng)(相關(guān)系數(shù)為0.415)，且與胎次(相關(guān)系數(shù)為0.320)對胎產(chǎn)羔數(shù)的影響相比效果更加顯著，這與前人在其他品種綿羊上得出的結(jié)果一致[5，8]。

由此可見，通過增加寒泊羊群體中B基因的頻率，有望提升母羊的胎產(chǎn)羔數(shù)；可利用B基因作為分子標記開展寒泊羊的品種選育工作，以期提高寒泊母羊的胎產(chǎn)羔數(shù)及整齊度。

4 結(jié)論

BMPR-IB基因在寒泊羊種群中存在BB、B+和++3種基因類型，其基因型頻率分別為16.66%、33.34%和50.00%，B基因?qū)μギa(chǎn)羔數(shù)具有正效應(yīng)。