VIVIEN FENG，張 羽，曹桂芝，吳日玥，陳 曦

近年來，兒童患齲明顯呈上升態(tài)勢(shì)，第四次全國(guó)口腔流行病學(xué)調(diào)查顯示，全國(guó)3歲兒童的齲患率為50.8%，4歲兒童為63.6%，到了5歲則高達(dá)71.9%[1]。通過齲病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)，早期發(fā)現(xiàn)并采取預(yù)防措施是控制齲病的關(guān)鍵[2]。

齲病活性檢測(cè)(caries activity tests, CAT)是早期檢測(cè)齲病風(fēng)險(xiǎn)的實(shí)驗(yàn)室方法，目前應(yīng)用較多的方法有檢測(cè)變形鏈球菌數(shù)量、觀察乳桿菌數(shù)量、觀察菌群分解蔗糖程度、測(cè)試唾液緩沖能力等[3]。其中Cariostat齲活躍性試驗(yàn)法是通過培養(yǎng)細(xì)菌，觀察培養(yǎng)基顏色變化從而判定致齲菌群生長(zhǎng)及分解蔗糖的程度，預(yù)測(cè)機(jī)體對(duì)齲病的易感性。該方法對(duì)兒童群體操作相對(duì)簡(jiǎn)單，無特殊實(shí)驗(yàn)室要求，結(jié)果判定容易，成為應(yīng)用于兒童齲易感性篩查中較為常用的判定齲活性的方法[4]。然而，由于進(jìn)口齲活性檢測(cè)產(chǎn)品成本較高且獲得渠道有限，尋找簡(jiǎn)便易得的試劑盒，評(píng)估兒童患齲風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

基于此，本研究的目的是通過比較一種國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基和日本標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基兩種齲活性測(cè)試劑在檢測(cè)細(xì)菌產(chǎn)酸方面的一致性、敏感性和準(zhǔn)確性，借此評(píng)估國(guó)產(chǎn)齲活性培養(yǎng)基的有效性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基：煜芽增菌培養(yǎng)基(滁洲瑞谷生物技術(shù)有限公司，安徽省滁洲市，中國(guó)，以下簡(jiǎn)稱國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基)；日本Cariostat培養(yǎng)基(Dentsply Sirona K.K.,Tokyo, 日本，以下簡(jiǎn)稱標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基)；腦心浸出液肉湯(Bacto Laboratories Pty Ltd,Liverpool, 英國(guó))；胰蛋白胨大豆瓊脂(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，青島，中國(guó))；革蘭染色試劑(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，珠海，中國(guó))；氯化鈉粉劑(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，青島，中國(guó))；0.9%氯化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海，中國(guó))；所采用的測(cè)試菌種為：變異鏈球菌UA159(Streptococcusmutans)；血鏈球菌ATCC10556(Streptococcussanguinis)；唾液鏈球菌ATCC25975(Streptococcussalivarius)；遠(yuǎn)緣鏈球菌ATCC6715(Streptococcussobrinus)；嗜酸乳桿菌ATCC4356(Lactobacillusacidophilus)；牙齦卟啉單胞菌ATCC33277(Porphyromonasgingivalis)；具核梭桿菌 ATCC25586(Fusobacteriumnucleatum)；黏性放線菌ATCC 27044(Actinomycesviscosus)。血鏈球菌及黏性放線菌標(biāo)準(zhǔn)菌株來源于上海哈靈生物科技有限公司，其余標(biāo)準(zhǔn)菌株均由上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院口腔微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 菌液的制備 上述8種細(xì)菌，接種于瓊脂/血培養(yǎng)基，37 ℃厭氧復(fù)蘇48 h，收集菌落做生化鑒定，確定為純培養(yǎng)后分別由腦心浸液(Brian-heart-infusion, BHI)中培養(yǎng)24～48 h增菌，革蘭染色后顯微鏡下觀察并攝片，確保菌株無污染后，離心收集細(xì)菌后由0.9%生理鹽水沖洗2次,將上述菌種分別置于紫外分光光度計(jì)540 nm處制備成紫外分光吸光度值在1.0±0.2的菌懸液。圖1示顯微鏡下的8種菌株。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 菌懸液梯度稀釋，用0.9%生理鹽水(0.9%NS)將菌懸液按照不同比例進(jìn)行稀釋為4組：未稀釋、1∶10、1∶100、1∶500。各濃度梯度的菌種重復(fù)4次。并設(shè)置0.9%生理鹽水為空白對(duì)照組。

將上述稀釋梯度及空白對(duì)照分別取100 μL加入至國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基及標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中。37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。依據(jù)產(chǎn)品說明書，在同一光源條件下，3名經(jīng)過培訓(xùn)并且一致性良好的讀數(shù)員采用盲法讀數(shù)，即由試驗(yàn)者打亂培養(yǎng)基順序后讀數(shù)。

讀數(shù)含義如下：0：陰性；1：較低患齲風(fēng)險(xiǎn)；2：中度患齲風(fēng)險(xiǎn)；3：高度患齲風(fēng)險(xiǎn)，其中0和1又記為0(低風(fēng)險(xiǎn)),2和3記為1(中高風(fēng)險(xiǎn))。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行國(guó)產(chǎn)與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基讀數(shù)的卡方檢驗(yàn)(計(jì)算Kappa值)，并計(jì)算準(zhǔn)確率、敏感性、特異性，統(tǒng)計(jì)中顯著性檢驗(yàn)水平設(shè)為0.05。

2 結(jié) 果

本次國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基讀數(shù)結(jié)果見表1。按照患齲的低風(fēng)險(xiǎn)和中高風(fēng)險(xiǎn)分別記為0和1，對(duì)讀數(shù)重新編碼，檢查者1、2、3的Kappa值分別為0.803、0.785和0.832(P<0.001)(表2)；3名檢查者匯總數(shù)據(jù)后Kappa值為0.807(P<0.001)(表3)。以標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基為準(zhǔn)，國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基敏感性為94.7%，特異度為84.7%，準(zhǔn)確率為90.1%。

表1 檢查者原始讀數(shù)匯總

表2 各檢查者齲風(fēng)險(xiǎn)讀數(shù)(重編碼)

表3 檢查者齲風(fēng)險(xiǎn)讀數(shù)匯總(重編碼)

3 討 論

齲病是一種在多因素影響下，以細(xì)菌為主的牙體硬組織發(fā)生慢性進(jìn)行性破壞的一種疾病[5]。兒童齲病發(fā)病率高居兒童常發(fā)疾病的首位，根據(jù)我國(guó)第四次全國(guó)口腔健康流行病學(xué)調(diào)查報(bào)道顯示，全國(guó)3～5歲年齡組乳牙患齲率為62.5%[1]，對(duì)兒童齲齒的預(yù)防顯得尤為重要。

菌斑既是齲病的病因, 又是齲病發(fā)生的環(huán)境,其產(chǎn)酸能力大小是判斷牙菌斑致齲力的重要指標(biāo)之一,牙菌斑內(nèi)的產(chǎn)酸代謝活動(dòng)是產(chǎn)生齲病損害的直接原因[1-2,5]。

如今，致齲微生物作為齲發(fā)生的預(yù)測(cè)指標(biāo)已經(jīng)得到了認(rèn)可，在致齲微生物中，變形鏈球菌和乳桿菌與齲病發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)系已非常明確[6]。對(duì)早期釉質(zhì)齲的研究發(fā)現(xiàn), 齲活躍人群的牙菌斑中變形鏈球菌、乳桿菌等產(chǎn)酸、耐酸力強(qiáng)的細(xì)菌含量較不活躍人群明顯增高，其中變形鏈球菌的水平可以作為低齡兒童齲的預(yù)測(cè)指標(biāo)[7-8]。通過多項(xiàng)對(duì)低齡兒童患齲的細(xì)菌學(xué)研究表明，患齲兒童菌斑中變形鏈球菌的檢出率及變形鏈球菌占總鏈球菌的百分比均明顯高于無齲兒童[9]。Cariostat是通過檢測(cè)菌斑產(chǎn)酸能力來評(píng)估齲易感性的方法之一，菌斑中產(chǎn)酸致齲菌在試劑培養(yǎng)基內(nèi)經(jīng)恒溫培養(yǎng)分解代謝蔗糖生成乳酸,使試劑中特定的pH 指示劑產(chǎn)生顯色反應(yīng),顯色變化能反映乳酸的生成量,由此推斷采樣標(biāo)本中致齲菌的量及機(jī)體的齲病活躍性[4-5,10]。有研究顯示Cariostat值在嬰兒期已顯示出和低齡兒童齲的顯著相關(guān)性，對(duì)低齡兒童齲的發(fā)展起到早期預(yù)測(cè)作用[11-12]。以Cariostat為代表的齲易感性檢測(cè)操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確且可多次重復(fù)，適宜應(yīng)用于預(yù)測(cè)兒童患齲風(fēng)險(xiǎn)[13-14]。但由于進(jìn)口檢測(cè)試劑的渠道和價(jià)格的限制，在臨床持續(xù)應(yīng)用及群體篩查工作中并未普及。本次實(shí)驗(yàn)選擇的國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基取樣方法亦簡(jiǎn)便無損傷，與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的產(chǎn)品主要組成成分相似，均由胰蛋白胨、蔗糖、氯化鈉、溴甲酚等組成，所培養(yǎng)的細(xì)菌以胰蛋白為氮源、以蔗糖為碳源、以溴甲酚為酸性顯示劑，培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)酸從而改變培養(yǎng)基的顏色[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)選擇的8種標(biāo)準(zhǔn)菌是口腔內(nèi)的主要致病菌，除了常見的產(chǎn)酸、耐酸菌株如變形鏈球菌和嗜酸乳桿菌外，本次實(shí)驗(yàn)也選用了具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌等牙周致病菌。選擇此類非產(chǎn)酸耐酸菌作為陰性對(duì)照，以驗(yàn)證國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基對(duì)于其他非酸性產(chǎn)物無陽性反應(yīng)。但本實(shí)驗(yàn)只選用了8種標(biāo)準(zhǔn)菌株，而非混合菌斑，不能代表人體內(nèi)菌斑的實(shí)際情況。今后應(yīng)進(jìn)一步檢測(cè)兩種培養(yǎng)基在檢測(cè)體內(nèi)混合菌斑方面的一致性，以提供更多數(shù)據(jù)。

針對(duì)兩種培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)讀數(shù)，3名檢查者所得到的Kappa值介于0.78～0.83，總Kappa值為0.8以上，證明國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基對(duì)于判斷齲低危和中高危方面，是完全可靠的。但兩種培養(yǎng)基還存在一定差異，推測(cè)可能的原因是：國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基組分近似，但各成分濃度的細(xì)微差異使得兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)出的致齲菌濃度仍存在一定差異。就本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基敏感性高于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，即國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基診斷得分普遍高于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，可以更敏感地識(shí)別有齲易感性的兒童，但相較于敏感度，其特異性尚顯不足。今后仍需結(jié)合其他檢測(cè)方法，用于大規(guī)模人口的篩查。

目前，齲活性實(shí)驗(yàn)主要用于流行病學(xué)調(diào)查中目標(biāo)人群的篩查，要求所采用的試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、成本低廉。然而目前常用的進(jìn)口齲活性檢測(cè)產(chǎn)品成本較高,并且產(chǎn)品獲得渠道受限,限制了國(guó)內(nèi)相關(guān)研究的開展。此次實(shí)驗(yàn)旨在通過實(shí)驗(yàn)室的前期研究，檢驗(yàn)國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基在檢測(cè)細(xì)菌產(chǎn)酸方面的效果，為進(jìn)一步推廣使用國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基提供實(shí)驗(yàn)室的依據(jù)和數(shù)據(jù)。本次實(shí)驗(yàn)選擇的國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基可能是一種非常有希望的替代品，但其是否能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)齲易感性仍需進(jìn)一步的針對(duì)人群的前瞻性研究。同時(shí)，科學(xué)準(zhǔn)確評(píng)估患齲風(fēng)險(xiǎn)是兒童齲病預(yù)防中的重要一環(huán)。齲病為多因素致病疾病，國(guó)際常用齲風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系都是多因素綜合的系統(tǒng)，包括美國(guó)兒童牙科學(xué)會(huì)(AAPD)研發(fā)的Caries-riskAssessmentTool，美國(guó)加尼福利亞牙科協(xié)會(huì)研發(fā)的CariesManagementbyRiskAssessment；美國(guó)牙科協(xié)會(huì)(ADA)研發(fā)的Caries-riskAssessmentSystem；瑞典研發(fā)的cariogram等[17-20]。但上述齲風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系不適用于國(guó)人，且單一預(yù)測(cè)方法尚無法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)齲病易感性，因此后續(xù)研究包括：繼續(xù)尋求更多高準(zhǔn)確度、高性價(jià)比、易獲取的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品(如唾液流速相關(guān)產(chǎn)品、唾液緩沖能力檢測(cè)產(chǎn)品等)；建立健全適用于我國(guó)兒童的，綜合臨床檢查、病史、口腔細(xì)菌環(huán)境等多因素的齲病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估系統(tǒng)，更好地為我國(guó)人群的齲病預(yù)防服務(wù)。