陳蔚婷，蔣備戰(zhàn)

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)作為糖胺聚糖家族成員，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。它是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺的雙糖單位重復(fù)數(shù)千次組成的大分子酸性粘多糖，分子量可達(dá)到5×106ku。透明質(zhì)酸由細(xì)胞膜上一組高度專一性的透明質(zhì)酸合成酶(hyaluronic acid synthase, HAS)合成，并分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中。HAS有3種保守的同工酶，在哺乳動物中，分別為HAS1、HAS2、HAS3。HAS1和HAS2能夠合成高分子量透明質(zhì)酸(2 000 ku)，而HAS3合成低分子量透明質(zhì)酸(100～1 000 ku)[1]。透明質(zhì)酸具有許多不同的生物學(xué)功能，能夠維持組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、重塑組織、調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)變化、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)，細(xì)胞粘附及細(xì)胞的增殖分化等。研究證明透明質(zhì)酸在多種生理和病理過程中作為一種重要的調(diào)節(jié)劑，特別在炎癥反應(yīng)中具有重要的作用[2-3]。近年來，透明質(zhì)酸在口腔疾病治療中的應(yīng)用日益受到關(guān)注，特別是其在顳下頜關(guān)節(jié)炎[4]、牙周炎[5]、種植體周圍炎[6]等感染性炎癥疾病的治療中取得了較好的療效[7]。透明質(zhì)酸還可以作為支架材料應(yīng)用于組織工程以實現(xiàn)組織的再生[8-9]。Ferroni等運用外源性透明質(zhì)酸支架復(fù)合人牙髓干細(xì)胞，在體外成功獲得牙髓樣組織[10]。然而機體內(nèi)源性透明質(zhì)酸及其合成酶與牙髓組織炎癥狀態(tài)的相關(guān)研究至今鮮有報道。因此，本研究旨在通過系統(tǒng)檢測炎癥牙髓組織中內(nèi)源性透明質(zhì)酸及其合成酶的表達(dá)，為研究其在牙髓組織炎癥調(diào)控過程中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本的收集

本研究經(jīng)同濟大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，事先向患者告知，知情同意后進行。臨床收集患者因埋伏阻生而預(yù)防性拔除的健康下頜第三磨牙(n>5)，以及萌出后因齲壞導(dǎo)致牙髓炎而拔除的下頜第三磨牙(n>5)。

1.2 組織學(xué)處理及蘇木素-伊紅(HE)染色

在無菌操作臺內(nèi)，使用高速渦輪機縱向磨開正常及炎癥狀態(tài)的第三磨牙，不傷及牙髓組織情況下取出正常及炎癥狀態(tài)的牙髓組織。PBS沖洗后用4%多聚甲醛(PFA)固定在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)中，室溫固定20 h，石蠟包埋。制作5 μm厚的組織學(xué)切片，60 ℃烤片過夜，4 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｇ衅糜诤罄m(xù)HE染色，免疫組織化學(xué)染色以及免疫熒光共染。將預(yù)備好的切片經(jīng)脫蠟、二甲苯和乙醇梯度復(fù)水，常規(guī)HE染色、光鏡觀察組織學(xué)變化，確定牙髓組織正常及炎癥狀態(tài)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色及免疫熒光染色實驗

本次實驗所有購買的抗體都有在線驗證數(shù)據(jù)，具體信息如下。一抗：兔多克隆抗-TNFα(1∶100, Immunoway, YT-4689, 美國)；羊多克隆抗-HA(1∶100, Abcam, ab-53842, 美國)；山羊多克隆抗-HAS1(1∶100, Santa Cruz, sc-23145, 美國)；兔多克隆抗-HAS2(1∶100, 博士德, ba3397, 中國)和山羊多克隆抗-HAS3(1∶100, Santa Cruz, sc-34204, 美國)。二抗：Alexa Fluor?488-驢抗兔IgG(1∶200, Life technology, 美國)；Alexa Fluor?546-驢抗山羊IgG(1∶200, Life technology, 美國)和donkey anti-goat IgG(1∶1 000, Abcam, ab-6884, 美國)。

免疫組化染色使用免疫組化試劑盒(邁新, KIT9707-兔, 中國)。組織切片常規(guī)脫蠟至水；PBS清洗后置于3% H2O2中10 min，滅活內(nèi)源性過氧化物；37 ℃酶消化法孵育1 h進行抗原修復(fù)，PBS漂洗后5% BSA孵育30 min，再在4 ℃和一抗孵育過夜。陰性對照組的組織切片用PBS代替一抗孵育。PBS漂洗后二抗室溫孵育20 min，再次PBS漂洗后與鏈霉親和素標(biāo)記的過氧化物酶室溫反應(yīng)20 min，以3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)為顯色劑，蘇木素復(fù)染，封片劑(YEASEN, 36307ES08, 上海)封片，立體顯微鏡(Carl Zeiss, Stemi508,德國)及數(shù)碼顯微鏡(Nikon Eclipse 80i, 日本)觀察。

免疫熒光檢測先將組織切片與熒光二抗在室溫下孵育1 h。使用DAPI(Sigma, D9542-10MG, 美國)進行細(xì)胞核染色，使用甘油封片，鏡檢拍照，熒光顯微鏡觀察((尼康 DS-Ri1-U3, 日本)；(尼康Intersilight C-HGF1, 日本))。

1.4 實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)

用Trizol試劑(Life Technologies, Carlsbad, CA, 美國)裂解牙髓組織，分離總RNA。提取的RNA用互補DNA合成試劑盒(Roche, Schlieren, 瑞士)進行逆轉(zhuǎn)錄，用FastStart Essential DNA Green Master(Roche, Schlieren, 瑞士)進行反應(yīng)，qRT-PCR法反應(yīng)檢測IL-6、IL-8、TNFα、HAS1、HAS2 及 HAS3的mRNA的表達(dá)。采用Roche.LC96分析軟件分析PCR過程，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，以CT值代表熒光qRT-PCR的結(jié)果，ΔCT = CT目的基因-CT內(nèi)參基因，ΔΔCT = ΔCT實驗組-ΔCT對照組。根據(jù)公式2-ΔΔCT計算出實驗組中目的基因的相對表達(dá)量，根據(jù)溶解曲線判斷擴增產(chǎn)物的特異性。使用SPSS 20.0單因素ANOVA進行統(tǒng)計學(xué)分析，Graphpad 7.0進行繪圖。引物序列見表1。

表1 HAS1、HAS2、HAS3、IL-6、IL-8、TNFα引物序列

2 結(jié) 果

2.1 HE染色

HE染色結(jié)果顯示，與正常牙髓組織相比，炎癥牙髓組織中出現(xiàn)組織炎癥改變，如炎性細(xì)胞浸潤、膠原纖維增厚、空泡變性、成牙本質(zhì)細(xì)胞層排列紊亂甚至組織壞死(圖1a,d)。

正常牙髓(a, b, c, g, h, i)；炎癥牙髓(d, e, f, j, k, l)；HE(a, d)；TNFα(b, e)；HA(c, f)；HAS1(g, j)；HAS2(h, k)；HAS3(i, l)

2.2 免疫組織化學(xué)染色

常規(guī)免疫組化染色結(jié)果提示，在正常牙髓組織中幾乎無法檢測到TNFα的表達(dá)，而在炎癥牙髓組織中TNFα的表達(dá)明顯強于正常牙髓組織。正常牙髓組織中可檢測到HA以及HAS1、HAS2、HAS3的表達(dá)。在炎癥牙髓組織中的HA、HAS2以及HAS3的表達(dá)比正常牙髓組織的表達(dá)明顯(圖1b, c, e, f, h, i, k, l)。HAS1在兩種牙髓組織中的表達(dá)均較弱，無明顯差異(圖1g, j)。

免疫熒光染色結(jié)果提示，在炎癥牙髓組織中TNFα、HA的表達(dá)均分別強于它們在正常牙髓組織中的表達(dá)，且TNFα和HA之間可見熒光共染色，即在TNFα表達(dá)增強的區(qū)域，透明質(zhì)酸表達(dá)亦相應(yīng)增強(圖2a～h)，而HAS1在健康和炎癥牙髓組織中的表達(dá)均較弱，其與TNFα在炎性牙髓組織中的表達(dá)不一致(圖2i～p)；在TNFα表達(dá)增強的炎癥牙髓組織區(qū)域，HAS2(圖3a～h)和HAS3(圖3i～p)表達(dá)也很明顯，且HAS2的熒光染色信號比HAS3更強。

正常牙髓組織(a, b, c, d, i, j, k, l)；炎癥牙髓組織(e, f, g, h, m, n, o, p)；DAPI(a, e, i, m)；TNFα(b, f, j, n)；HA(c, g)；HAS1(k, o)；TNFα/HA雙標(biāo)共染(d, h)；TNFα/HAS1雙標(biāo)共染(l, p)

正常牙髓組織(a, b, c, d, i, j, k, l)；炎癥牙髓組織(e, f, g, h, m, n, o, p)；DAPI(a, e, i, m)；TNFα(b, f, j, n)；HAS2(c, g)；HAS3(k, o)；TNFα/HAS2雙標(biāo)共染(d, h)；TNFα/HAS3雙標(biāo)共染(l, p)

2.3 實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)

qRT-PCR結(jié)果和組織學(xué)染色結(jié)果一致，顯示在炎癥牙髓組織樣本中,IL-6、IL-8、TNFα(PIL-6=0.000 017；PIL-8=0.000 016;PTNFα=0.000 589)的mRNA表達(dá)明顯較正常牙髓組織有明顯的增加(圖4A)；與此同時，HAS2、HAS3(PHAS2=0.003 373;PHAS3=0.000 123)的mRNA表達(dá)量亦較正常牙髓有明顯的增加。HAS1的表達(dá)量在炎癥牙髓組織中較正常牙髓組織中稍有增加(P=0.025 232)(圖4B)。P<0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

A：正常及炎癥牙髓組織中IL-6、IL-8、TNFα的mRNA的表達(dá)；B：正常及炎癥牙髓組織中HAS1、HAS2、HAS3的mRNA表達(dá)

3 討 論

牙髓是來源于外胚間充質(zhì)的疏松結(jié)締組織，位于由牙本質(zhì)所形成的髓腔內(nèi)，借狹窄的根尖孔與根尖周組織相連，由于缺乏足夠的血液循環(huán)，因而極其脆弱。齲齒、牙外傷等都可引起牙髓組織感染性炎癥，最終導(dǎo)致牙髓壞死甚至根尖周病變。牙髓組織在感染狀態(tài)下引起炎癥反應(yīng)，釋放各種炎癥因子。炎癥反應(yīng)對感染狀態(tài)下的牙髓組織而言是一把雙刃劍，輕微的炎癥可以刺激牙髓組織中的牙髓干細(xì)胞遷移到受傷部位，隨后分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞并參與形成牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體并產(chǎn)生修復(fù)性牙本質(zhì)。嚴(yán)重的炎癥引起不可逆的牙髓炎導(dǎo)致牙髓組織壞死[11]。透明質(zhì)酸是牙髓組織中細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、血管與細(xì)胞間的物質(zhì)傳遞中發(fā)揮重要的功能，但有關(guān)透明質(zhì)酸在牙髓組織炎癥狀態(tài)的表達(dá)以及作用至今仍不清楚。

本次實驗通過HE染色觀察到炎癥牙髓組織樣本組織學(xué)的改變，通過免疫組織化學(xué)實驗檢測到其中TNFα的免疫染色陽性表達(dá)結(jié)果、采用qRT-PCR 進一步驗證了炎癥因子IL-6、IL-8、TNFα在炎癥牙髓組織樣本中表達(dá)升高，以上結(jié)果均證明了所取牙髓組織的炎癥狀態(tài)，可用于后續(xù)的研究。研究結(jié)果同時表明在炎癥牙髓組織中，HA、HAS2及HAS3的免疫染色強度較在正常牙髓組織中有明顯增強，相關(guān)合成酶的mRNA表達(dá)亦較正常牙髓組織中明顯升高，這些結(jié)果都進一步表明透明質(zhì)酸可能參與牙髓組織炎癥狀態(tài)的調(diào)控。

透明質(zhì)酸分子是一個長的線性聚合物結(jié)構(gòu)，分子量范圍4.0×103～5.0×106ku。以往研究表明，透明質(zhì)酸對組織炎癥狀態(tài)的調(diào)控和其分子量大小相關(guān)。大分子量透明質(zhì)酸(HMWHA)由HAS1、HAS2合成，具有抗炎活性，而低分子量的透明質(zhì)酸(LMWHA)則由HAS3合成，可以促進炎癥的進程[12]。研究表明，LMWHA能夠啟動NF-κB信號傳導(dǎo)進而誘導(dǎo)炎癥，從而在各種類型的細(xì)胞中產(chǎn)生如包括IL-6、IL-8及TNFα在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子和趨化因子[13]。在人牙髓細(xì)胞中的研究證實，HMWHA有利于損傷后炎癥狀態(tài)下的組織修復(fù)[14]。另一方面，炎癥介質(zhì)可以通過調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸合成酶的表達(dá)，調(diào)節(jié)所合成的透明質(zhì)酸的分子大小，參與炎癥反應(yīng)[15]。本次實驗免疫熒光染色結(jié)果提示炎癥牙髓組織中TNFα表達(dá)增強的區(qū)域HAS2、HAS3的表達(dá)均明顯升高，并且HAS2的熒光染色信號明顯比HAS3更強。HAS2和HAS3之間的表達(dá)差異提示我們不同分子量大小的透明質(zhì)酸都可能參與了牙髓組織炎癥狀態(tài)的調(diào)節(jié)；并且，HAS2及其合成的具有抗炎活性的HMWHA較HAS3及其合成具有促炎活性的LMWHA而言，在牙髓組織的炎癥調(diào)控中可能更加占據(jù)優(yōu)勢。免疫染色結(jié)果提示HAS1在炎癥牙髓組織中的表達(dá)和正常牙髓組織中的表達(dá)均較弱，且兩者之間的差異并不明顯。以往的文獻(xiàn)表明HAS1主要在生長發(fā)育階段發(fā)揮重要作用[16]，這和我們早前的實驗結(jié)果保持一致[17]。因此推測在發(fā)育成熟的恒牙牙髓組織中，HAS1對牙髓炎癥狀態(tài)的調(diào)控作用弱于HAS2及HAS3。

綜上所述，本次研究采用免疫染色以及qRT-PCR檢測的方法，在炎癥牙髓組織中檢測到了HA、HAS2及HAS3的高表達(dá)，結(jié)果提示牙髓組織中內(nèi)源性透明質(zhì)酸及其合成酶HAS2、HAS3都可能參與了對牙髓組織炎癥感染狀態(tài)的調(diào)控。然而透明質(zhì)酸調(diào)控牙髓組織炎癥狀態(tài)的具體作用機制以及HAS2、HAS3在牙髓組織炎癥狀態(tài)的調(diào)控中發(fā)揮的具體作用仍有待進一步探討研究。