魏 蓉，張 源，李新月

牙周炎是一種發(fā)生于牙齒支持組織、病因復(fù)雜的慢性感染性疾病，在其始動因子牙菌斑生物膜作用下激活機體免疫炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致牙周組織破壞，其表現(xiàn)之一便是牙槽骨吸收，是成年人失牙的主要原因[1]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是P.gingivalis的毒力因子之一[2]，并與牙槽骨吸收密切相關(guān)[3]。LPS除直接破壞牙周支持組織外，還可引發(fā)宿主免疫炎癥反應(yīng)，激活機體免疫應(yīng)答機制[4]。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)作為固有免疫應(yīng)答的重要防線，在牙周炎發(fā)生發(fā)展中起到了重要的防御作用[5]。LPS可作為TLRs的配體與其結(jié)合后在牙周炎中發(fā)揮重要作用[6]。骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein，BSP)是一種高度糖基化、磷酸化的糖蛋白，能夠在骨細胞外基質(zhì)沉積，并能促進羥基磷灰石成核，對于成骨細胞分化、骨基質(zhì)礦化都具有重要意義，并且在骨、牙骨質(zhì)、牙本質(zhì)的初始礦化中具有潛在作用[7]。LPS能夠在hPDLFs中引起B(yǎng)SP下調(diào)，與牙槽骨代謝息息相關(guān)[8]。

miRNA是一組廣泛存在于真核生物體內(nèi)的單鏈非編碼RNA，長度約22個核苷酸，通過完全或不完全的堿基互補配對原則，與特定mRNA的3′UTR或5′UTR結(jié)合后降解mRNA或抑制其翻譯進而抑制蛋白表達，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達[9]。它能夠參與調(diào)控免應(yīng)答反應(yīng)[10-11]，在牙周炎中也起到了重要的調(diào)控作用[12]。因此，本研究篩選TLR2具有負性調(diào)控關(guān)系的miRNA，進而研究LPS介導(dǎo)下hPDLFs中miRNA與TLR2及miRNA與BSP的作用關(guān)系，初步探究miRNA在牙周炎骨代謝過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

DMEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL，美國)、胰蛋白酶(GIBCO BRL，美國)、胎牛血清(GIBCOBRL，美國)、Trizol試劑(Invitrogen，美國)、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Takara，日本)、RNA酶抑制劑(Takara，日本)、dNTP(10 mmol/L)(Takara，日本)、SYBRPremix ExTaq試劑盒(TaKaRa, 日本)、CG-02/05實時熒光定量PCR儀(HealForce,中國)、正常熔點/低熔點的瓊脂糖凝膠(GIBCO，美國)、CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Forma，美國)、超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、P.gingivalisLPS(InvivoGene,美國)、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix forqPCR(+gDNAwiper)(諾唯贊生物，中國)、DYCP-31BM型水平電泳裝置(北京市六一儀器廠)、LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)(UVP, 美國)、TS-1型搖床(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 目標miRNA的篩選 用生物信息學(xué)技術(shù)篩選與TLR2具有靶向結(jié)合關(guān)系的miRNA：用TargetScan、MiRanda、PicTar4、RNAhybrid數(shù)據(jù)庫查找和篩選TLR2基因(物種為人)的3′UTR序列，并結(jié)合已報道文獻中通過luciferase檢測證明與TLR2具有靶向作用位點并具有負性調(diào)控關(guān)系的miRNA作為研究對象，得到miR-23a、miR-144、miR-19a作為目標miRNA[13-16]。

1.2.2 hPDLFs的培養(yǎng)及處理 取因正畸拔除的前磨牙(已通過天津市口腔醫(yī)院倫理審查)根中1/3牙周膜組織剪碎成 1 mm3小組織塊，移植至24孔板，用含 10% FBS、1%雙抗的 DMEM 培養(yǎng)液，置 37 ℃含 5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)。待hPDLFs完全融合后按1∶3比例傳代。待第3代細胞貼壁后，用PBS漂洗1次，換為礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)(礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基：去酚紅 DMEM，10%FBS，1×10-8mol/L 地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50 μg/mL抗壞血酸)，使其骨向分化，隔3 d換1次培養(yǎng)液，長滿后傳代。接種至6孔板，待90%融合后更換不含血清的礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用無血清DMEM配置的濃度為10 mg/LP.gingivalisLPS處理培養(yǎng)8 h后，收集細胞。

1.2.3 hPDLFs中miRNA及TLR2的mRNA表達水平檢測 用Trizol試劑按其說明分別提取各組hPDLFs中的總RNA 1 μL，按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶及HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)要求逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA(逆轉(zhuǎn)錄序列見表1)及擴增，以U6為內(nèi)參，引物序列由天津賽爾生物技術(shù)有限公司設(shè)計(引物序列見表2)，實時熒光定量法測定miRNA的mRNA表達水平，同時測定TLR2的mRNA表達水平(以β-actin為內(nèi)參)。反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min, 94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s 40個循環(huán)。用相對定量公式2-ΔΔCt(分別計算待測基因與內(nèi)參的Ct平均值，兩者之差為ΔCt，實驗組與對照組之間為ΔΔCt)對結(jié)果進行檢測，同樣的實驗重復(fù)3次。選擇與TLR2呈負性表達關(guān)系的miR-144作為進一步研究對象。

表1 制備cDNA的RT序列

表2 熒光定量PCR引物序列

1.2.4 hPDLFs的轉(zhuǎn)染 按1.2.2繼續(xù)培養(yǎng)hPDLFs，轉(zhuǎn)染前1 d用含有10%FBS的 DMEM礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液終止消化并吹打混勻細胞，將細胞接種至6孔板中，置 37 ℃含 5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18～24 h，使次日轉(zhuǎn)染時細胞達到 70%～80%板底面積。分別用無血清培養(yǎng)基3 μL稀釋(1)空白對照組、(2)陰性對照組(LPS組)、(3)miRNA過表達對照組(LPS+miRNA-144 mimics control組)、(4)miRNA過表達組(LPS+miR-144 mimics組)、(5)miRNA抑制對照組(LPS+miRNA-144 ASO NC組)、(6)miRNA抑制組(LPS+miR-144 ASO組)，終量50 μL，分別加入50 μL脂質(zhì)體Lipofectamine 2000混勻制成轉(zhuǎn)染液，加入對應(yīng)孔中，100 μL/孔。每孔滴加300 μL Opti-MEM,常規(guī)培養(yǎng)4 h后每孔換為10%FBS礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液3 mL，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48 h，將(2)～(6)共5組hPDLFs加入用無血清 DMEM配制的終濃度為 10 mg/LP.gingivalisLPS刺激8 h，空白對照組(1)更換為不含血清的礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8 h，收集細胞，提取 RNA和裂蛋白。

1.2.5 Real-time PCR法檢測BSP及TLR2的mRNA表達水平 各組樣本細胞長滿后用Trizol試劑提取總RNA，實時熒光定量法測定TLR2及BSP的mRNA表達水平，實驗方法同1.2.3。

1.2.6 Western Blot檢測BSP及TLR2的蛋白表達水平 收集1.2.4中各組樣本提取總蛋白，各組取40 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至PADF膜上形成印跡，室溫下脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃下與一抗結(jié)合搖床過夜，浸洗后與二抗結(jié)合1.5 h浸洗顯影，曝光顯影并進行定影處理。膠片用LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)進行攝像，分析各組蛋白條帶的亮度值，與對應(yīng)GAPDH(內(nèi)參照)條帶亮度值相比，得到校正后的各組蛋白的條帶亮度值，實驗重復(fù)3次取平均值，并繪制柱狀圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 20.0對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以均值±標準差表示。兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05，以P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。繪圖由Graphpad Prism 7.0軟件完成。

2 結(jié) 果

2.1 hPDLFs體外培養(yǎng)

牙周膜組織塊接種后3～6 d可見細胞游離出來，但尚不能分辨細胞結(jié)構(gòu)；接種20 d后，可見大量成纖維細胞向四周呈放射狀生長；傳代后細胞呈放射狀或旋渦狀生長，形態(tài)與原代相同：鏡下呈長梭形，胞體豐滿，胞質(zhì)均勻，細胞透明度大，細胞核圓形或卵圓形，核仁清晰(圖1)。

圖1 第4代hPDLFs(倒置顯微鏡 ×40)

2.2 P.gingivalis LPS上調(diào)hPDLFs中TLR2的表達水平

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，hPDLFs經(jīng)10 mg/LP.gingivalisLPS刺激8 h后，TLR2的mRNA表達水平明顯上調(diào)約13.6倍，且其上調(diào)水平與正常組相比具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.000，圖2)。

實時熒光定量PCR法檢測TLR2的mRNA表達水平，與對照組相比，*：P<0.05

2.3 目標miRNA在正常及LPS誘導(dǎo)hPDLFs中的表達

實時熒光定量PCR顯示，正常hPDLFs中有miR-19a、miR-23a、miR-144表達，10 mg/L LPS刺激hPDLFs 8 h后，miR-19a、miR-23a表達水平上調(diào)，其中miR-19a上調(diào)約2.6倍，miR-23上調(diào)約1.8倍；而miR-144表達水平下調(diào)約6/100。其中上調(diào)的miR-19a、下調(diào)的miR-144與正常組對照均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.002，P=0.000，圖3)。選擇表達水平下調(diào)的miR-144作為進一步研究對象。

實時熒光定量PCR法檢測miRNA的mRNA表達水平，與對照組相比，*：P<0.05

2.4 miR-144對hPDLFs在LPS誘導(dǎo)下TLR2表達水平的影響

miRNA-144 過表達對照組、miR-144過表達組、miR-144抑制對照組、miR-144抑制組分別體外轉(zhuǎn)染礦化誘導(dǎo)的hPDLFs，并經(jīng)10 mg/L LPS誘導(dǎo)8 h，與空白對照組和單純LPS刺激組比較TRL2的mRNA及蛋白表達水平，PCR結(jié)果顯示：與空白對照組相比，10 mg/L LPS誘導(dǎo)能明顯激活hPDLFs中TLR2的表達(P=0.007)；miR-144過表達組TLR2的mRNA表達水平明顯低于miR-144過表達對照組(P=0.002)和陰性對照組(P=0.007)，過表達miR-144明顯降低LPS對TLR2 mRNA表達的激活作用；miR-144抑制組TLR2的mRNA表達水平明顯高于抑制miR-144組(P=0.012)和陰性對照組(P=0.017)，miR-144明顯上調(diào)TLR2的mRNA表達水平，與LPS具有協(xié)同作用(圖4A)。Western Blot結(jié)果顯示：過表達miR-144可以降低LPS誘導(dǎo)的TLR2的蛋白表達水平，抑制miR-144可以進一步升高LPS誘導(dǎo)的TLR2的蛋白表達水平(圖4B)；每組對應(yīng)蛋白條帶見圖4C。

A：實時熒光定量PCR檢測TLR2的mRNA表達水平；B：WesternBlot檢測TLR2的蛋白表達水平；*：P<0.05；C：分別對應(yīng)圖4B分組的蛋白條帶

2.5 miR-144對hPDLFs在LPS誘導(dǎo)下BSP表達水平的影響

miRNA-144過表達對照組、miR-144過表達組、miR-144抑制對照組、miR-144抑制組分別體外轉(zhuǎn)染礦化誘導(dǎo)的hPDLFs，并經(jīng)10 mg/L LPS誘導(dǎo)8 h，與空白對照組和陰性對照組比較BSP的mRNA及蛋白表達水平，PCR結(jié)果顯示：與空白對照組相比，10 mg/L LPS能明顯下調(diào)hPDLFs中BSP的mRNA表達(P=0.016)；miR-144過表達組BSP的mRNA表達水平明顯高于miR-144過表達對照組(P=0.022)和LPS組(P=0.018)，miR-144明顯抵消LPS對BSPmRNA表達的抑制作用；miR-144抑制組BSP的mRNA表達水平明顯低于miR-144抑制對照組(P=0.005)和LPS組(P=0.021)，抑制miR-144明顯下調(diào)BSP的mRNA表達水平，與LPS具有協(xié)同作用(圖5A)。Western Blot結(jié)果顯示：過表達miR-144可以上調(diào)LPS抑制BSP蛋白表達，抑制miR-144可以進一步下調(diào)LPS抑制BSP蛋白表達(圖5B)；每組對應(yīng)蛋白條帶見圖5C。

A：為實時熒光定量PCR檢測BSP的mRNA表達水平；B：為Western Blot檢測BSP的蛋白表達水平；與對照組相比，*：P<0.05；與陰性對照組(單純LPS刺激)相比，*：P<0.05；C：為分別對應(yīng)圖5B分組的蛋白條帶

3 討 論

牙周炎會引起牙周軟組織炎癥、牙槽骨吸收，研究發(fā)現(xiàn)在炎性牙周組織中TLR2高表達并在牙周炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，相較于健康人群，牙周炎患者牙齦組織中TLR2高表達[17]。革蘭陰性菌感染時，其主要抗原成分LPS可與細胞表面受體TLR2/4結(jié)合，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)外界刺激激活細胞內(nèi)信號通路，造成牙周組織的破壞[18]，TLR2作為LPS的關(guān)鍵受體，同時作為固有免疫應(yīng)答的重要組成部分，在其中發(fā)揮了重要作用。在P.gingivalisLPS誘導(dǎo)的巨噬細胞牙周炎模型中也發(fā)現(xiàn)TLR2表達水平升高[19]。我們的研究發(fā)現(xiàn)hPDLFs經(jīng)LPS刺激后，TLR2同樣被激活，與以往研究結(jié)果一致。P.gingivalisLPS可以通過TLR2促進IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10[20-22]等促炎因子釋放。此外，LPS還能通過TLR2影響牙槽骨吸收，P.gingivalisLPS可通過TLR2引起骨代謝的重要角色——NF-κB配體激活受體(receptor of activator of NF-κB ligand，RANKL)表達變化介導(dǎo)牙槽骨吸收[23]。

牙周炎相關(guān)miRNA研究發(fā)現(xiàn)miRNA在炎性及健康牙周組織中異常表達[24]，且能影響下游炎性因子的表達并參與調(diào)控牙槽骨代謝[25-26]。我們通過生物信息學(xué)技術(shù)及文獻檢索發(fā)現(xiàn)miR-144與TLR2間具有靶向結(jié)合位點，且有研究證明在大鼠模型中TLR2與miR-144二者呈負性作用關(guān)系[14]。因此本研究篩選miR-144為研究對象，發(fā)現(xiàn)LPS刺激hPDLFs后，TLR2表達水平升高的同時miR-144表達水平降低。但是另有研究發(fā)現(xiàn)，相較于正常組織，miR-144在牙周炎性組織中呈高表達[27-28]，與本研究結(jié)果存在差異。分析此差異的原因，可能是在牙周炎環(huán)境中作為機體自我保護反應(yīng)性高表達miR-144，在miR-144上游或許存在更為復(fù)雜的調(diào)控機制，而非單純LPS刺激hPDLFs的細胞模型的單一環(huán)境。本研究亦發(fā)現(xiàn)miR-144在hPDLFs中抑制TLR2表達水平，能夠部分抵消LPS對TLR2的激活作用，從而證明了miR-144與TLR2的負向作用關(guān)系。

牙周炎相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)BSP在保持正常的牙周組織功能、牙槽骨重建中具有重要作用[29]。有研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激人牙周膜成纖維細胞后BSP的基因表達水平下調(diào)，其成骨能力被削弱[30]。在我們的前期研究中取得類似結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在hPDLFs中LPS對BSP的下調(diào)作用是通過TLR2及信號通路介導(dǎo)實現(xiàn)的[8]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，miR-144在抑制TLR2表達的同時上調(diào)BSP的表達，抵消LPS對BSP的抑制作用。進一步證明在LPS誘導(dǎo)的牙周炎中，miR-144具有與TLR2的負向作用，且促進了成骨蛋白BSP的表達。miRNA對BSP的調(diào)控作用的研究目前少有報道，其作用機制也尚不明了。因此miR-144對BSP的調(diào)控是否是通過TLR2介導(dǎo)的這一作用機制尚需進一步研究。

綜上，本研究證明了在hPDLFs中，miR-144能夠負性調(diào)控TLR2并與BSP表達呈正相關(guān)性，與LPS具有反向作用，在抑制牙周炎癥反應(yīng)、促進成骨方面可能具有積極作用，能夠為牙周炎骨代謝的基因?qū)W治療提供研究思路和實驗依據(jù)，為其今后的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。