韋婧 劉海洲 寧淑芳 張力圖

【關(guān)鍵詞】ITLN1;免疫;結(jié)腸癌;CIBERSORT

【中圖分類號(hào)】 R735.35 ?【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1002-8714（2020）05-0026-01

結(jié)直腸癌是世界第三大流行癌癥，但死亡率排名第二[1]。結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制涉及多種因素，包括環(huán)境和遺傳變量，而詳細(xì)的分子機(jī)制仍不清楚。非常需要特定的結(jié)腸癌生物標(biāo)志物和治療途徑來(lái)改善患者的預(yù)后。

研究發(fā)現(xiàn)半乳糖凝集素在許多人類實(shí)體和血液惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，并在腫瘤生物學(xué)中發(fā)揮重要作用，包括轉(zhuǎn)化，生長(zhǎng)，粘附，侵襲和侵襲[2]。Intelectin 1（ITLN1）是最近發(fā)現(xiàn)的一種分泌型和半乳糖呋喃糖結(jié)合型凝集素，許多研究表明ITLN1與腸道免疫密切相關(guān)[3， 4]，腫瘤來(lái)源的半乳糖凝集素可能對(duì)腫瘤和免疫細(xì)胞產(chǎn)生雙功能作用[5]。因此本研究重點(diǎn)探討ITLN1對(duì)結(jié)腸癌的免疫功能的影響。

本研究對(duì)TCGA的表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，評(píng)估ITLN1基因在結(jié)腸癌的表達(dá)和預(yù)后，通過(guò)GSEA基因集富集分析尋找與ITLN1表達(dá)相關(guān)的調(diào)通通路和生物學(xué)功能，并使用CIBERSORT算法探索了ITLN1基因的表達(dá)與結(jié)腸癌組織中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)獲取

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cancergenome.nih.gov/）下載結(jié)腸癌患者的表達(dá)譜測(cè)序數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)。去除臨床信息中生存時(shí)間缺失和生存時(shí)間小于30天的樣本，比對(duì)臨床和表達(dá)譜的樣本去除不重合的樣本，最后423個(gè)癌癥樣本和41個(gè)癌旁樣本被納入我們的分析。

1.2 差異表達(dá)分析及生存分析

我們從表達(dá)譜文件提取了ITLN1的表達(dá)值，R軟件中的非參數(shù)檢驗(yàn)wilcox.test來(lái)進(jìn)行COAD組和正常組的差異性檢驗(yàn)。根據(jù)ITLN1的表達(dá)值的中位數(shù)為界，將患者分為高或低表達(dá)兩組，Kaplan-Meier（KM）生存分析被用于評(píng)估ITLN1基因表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響。

1.3基因富集分析

為了鑒定ITLN1發(fā)揮的生物學(xué)功能，把表達(dá)譜數(shù)據(jù)按照ITLN1的表達(dá)量按上1/4與下1/4作為高低表達(dá)組，使用基于JAVA軟件的GSEA v3.0來(lái)鑒定ITLN1的下游調(diào)控通路，設(shè)定顯著性閾值P<0.05以及錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.25，基因集設(shè)為KEGG.SYMBOL.gmt。

1.4 CIBERSORT算法分析ITLN1基因與結(jié)腸癌的免疫相關(guān)性

采用CIBERSORT評(píng)估了ITLN1不同表達(dá)組中22種免疫細(xì)胞類型的組成，包括7種T細(xì)胞類型、幼稚和記憶B細(xì)胞、漿細(xì)胞、NK細(xì)胞和骨髓亞群。P <0.05時(shí)納入分析。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

生物信息學(xué)分析均使用R（v 3.5.1）軟件進(jìn)行，KM生存分析由“survival” R軟件包完成。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ITLN1基因在結(jié)腸癌中表達(dá)顯著降低

在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，與相鄰正常組織相比，ITLN1基因在結(jié)腸癌組織的表達(dá)水平降低（P <0.05;圖1A）。進(jìn)行 Kaplan-Meier分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITLN1表達(dá)較低的患者相比，ITLN1表達(dá)較高的患者生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P<0.05;圖1B）。

圖1 ITLN1基因的表達(dá)和預(yù)后

2.2基因集富集分析

GSEA富集分析結(jié)果提示ITLN1基因高表達(dá)樣本富集到造血細(xì)胞系、用于IGA生產(chǎn)的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)等免疫相關(guān)基因集（圖2）。

圖2 ITLN1的富集基因集和相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 ITLN1表達(dá)水平與免疫細(xì)胞亞型的相關(guān)性

CIBERSORT分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITLN1基因高表達(dá)組的漿細(xì)胞、靜止的CD4記憶T細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯增高，而M0巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯降低（圖3）。

圖3 用于比較ITLN1基因高表達(dá)組和低表達(dá)組之間的免疫細(xì)胞比例的小提琴圖

3 討論? ??

一系列研究表明ITLN1在腫瘤發(fā)生的潛在作用。ITLN1通過(guò)調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞中Sirt1依賴性p53脫乙?；饔么龠M(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ITLN1通過(guò)失活磷酸肌醇3-激酶/ AKT / Ikappa B激酶信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)減弱胃癌細(xì)胞中抑制HNF4α表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB的活性，抑制胃癌的進(jìn)展，ITLN1與胃癌患者的生存期延長(zhǎng)有關(guān)[7]。此外，人ITLN-1和小鼠intelectin-1（mITLN-1）可能在針對(duì)所選微生物或外源抗原的防御中發(fā)揮免疫學(xué)作用[3]。本研究發(fā)現(xiàn)ITLN在結(jié)腸癌表達(dá)明顯降低，是結(jié)腸癌的保護(hù)因子。

腸道某些細(xì)菌通過(guò)促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子（如干擾素-γ和白介素-17A）的產(chǎn)生而引發(fā)類似效應(yīng)子的免疫反應(yīng)，而其他細(xì)菌則促進(jìn)調(diào)節(jié)性CD4 T細(xì)胞的產(chǎn)生，并有助于腸道穩(wěn)態(tài)。微生物群對(duì)B細(xì)胞也有深遠(yuǎn)的影響。腸道微生物暴露導(dǎo)致B細(xì)胞庫(kù)的持續(xù)多樣化，并產(chǎn)生T依賴性和非依賴性抗體，尤其是IgA[8]。GSEA富集分析結(jié)果表明ITLN1參與多條免疫相關(guān)通路。我們推測(cè)ITLN1可能參與免疫調(diào)節(jié)，我們使用CIBERSORT，一種反卷積算法[9]評(píng)估ITLN1表達(dá)值組別與免疫細(xì)胞亞型之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITLN1高表達(dá)時(shí)漿細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯增高，而M0巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯降低。本研究發(fā)現(xiàn)ITLN1可能是在將幼稚B細(xì)胞成熟成分泌IgA的成熟漿細(xì)胞中發(fā)揮作用，是維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素之一。腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞（TAM）是另一個(gè)非常重要的免疫種群，可促進(jìn)或阻斷腫瘤的發(fā)展。巨噬細(xì)胞不同亞型（M0，M1和M2）都具有不同的免疫功能。M2巨噬細(xì)胞參與Th2型免疫應(yīng)答，抑制T細(xì)胞增殖和分化，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤基質(zhì)的血管生成[10]。大量文獻(xiàn)亦報(bào)道intelectins成員在炎癥及免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[5， 11]。