余方白 周占琴

（西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100）

關(guān)鍵字：乳腺組織 細胞 鑒定

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物。湖羊乳腺組織樣采自楊陵上落手屠宰場，屠宰后立即將乳腺組織樣品置于預(yù)冷、滅菌、加雙抗的PBS緩沖液（AA-PBS）中，封口膜封閉后1h內(nèi)帶回實驗室，進行乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 湖羊乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)與純化。將乳腺組織帶回實驗室，用酒精消毒并撕下封口膜，在超凈工作臺（蘇州安泰公司）把組織放入培養(yǎng)皿中，去除結(jié)締、脂肪等組織結(jié)構(gòu)，用AA-PBS多次清洗乳腺組織，直至溶液變得透明，沒有奶漬。然后將組織切片切碎成大約1mm3的立方體，用AA-PBS沖洗幾次，室溫保存2～3min，棄去上清、留下沉淀。將小塊組織置于培養(yǎng)皿中，在37℃、飽和濕度和5 % CO2條件下反向孵育。30min后，用移液槍向培養(yǎng)皿中加入2ml含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液。培養(yǎng)液每48h更換一次，直到細胞從組織中遷移出來，并明顯地散布在培養(yǎng)皿的底部。根據(jù)Shi等人的研究，培養(yǎng)約傳至第5代，獲得MECs。

本試驗利用胰酶對乳腺上皮細胞和成纖維細胞對消化時間的不同進行純化，即利用成纖維細胞相對于上皮細胞對胰酶更加敏感，容易脫落的原理進行分離純化。先用25%的胰酶（含EDTA）消化貼壁細胞，在倒置顯微鏡（日本Nikon公司）下觀察，等全部細胞回縮后，添加含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液立即終止消化，并進行吹打，將沒有消化下來的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，如此反復三次即可得到純的乳腺上皮細胞。

1.2.2 湖羊乳腺上皮細胞的鑒定。本試驗利用免疫熒光化學方法對湖羊乳腺上皮細胞進行鑒定。具體步驟包括：爬片、清洗、固定、透化、封閉、一抗孵育、二抗孵育、染色、封片、觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 湖羊乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)

通過組織塊貼壁法培養(yǎng)處理后的湖羊的乳腺組織樣，培養(yǎng)至第 10 天左右有大量細胞遷出，此時細胞形態(tài)不單一，消化遷出細胞，純化3-5次直至得到單一形態(tài)細胞，顯微鏡拍照，經(jīng)與前人研究的細胞狀態(tài)，形態(tài)對比，發(fā)現(xiàn)所得到的的細胞之前研究所描述的乳腺上皮細胞一致，如圖2-1即可確定本研究獲得了純化的湖羊乳腺上皮細胞。

2.2 湖羊乳腺上皮細胞的鑒定

本研究運用免疫熒光化學法鑒定湖羊乳腺上皮細胞。將所得到的湖羊乳腺上皮細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后，再經(jīng)過48 h的培養(yǎng)，如圖2-2A觀察發(fā)現(xiàn)上皮細胞呈現(xiàn)出半?yún)R合的單層上皮細胞樣，細胞核被DAPI染為藍色（圖2-2B），呈上皮細胞特有的角蛋白陽性（圖2C），說明本試驗培養(yǎng)的貼壁細胞為湖羊乳腺上皮細胞。

圖2-1 湖羊的乳腺上皮細胞Fig 2-1 Mammary epithelial cells of Hu sheep

圖2-2 湖羊乳腺上皮細胞免疫熒光鑒定

3 討論

乳腺上皮細胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于許多研究領(lǐng)域，例如泌乳機理，乳成分的生物合成，一些miRNA、激素以及功能基因等對乳腺上皮細胞的調(diào)控作用。在此之前的研究報道中對于乳腺上皮細胞培養(yǎng)的方法多為組織塊培養(yǎng)法和膠原酶消化法，以及兩種方法聯(lián)合。每種方法各有長處，可根據(jù)研究目的和要求進行選擇。本試驗采用組織塊細胞培養(yǎng)法來獲得所需細胞，經(jīng)過3～5次傳代純化，可獲得單細胞層、鵝卵石島嶼狀結(jié)構(gòu)的細胞，經(jīng)過免疫熒光技術(shù)鑒定可確定為湖羊乳腺上皮細胞，與前人研究結(jié)果一致。此方法只需用經(jīng)過胰蛋白酶的消化處理，因此能夠獲得活性高且生長狀態(tài)良好，細胞活力旺盛的細胞，這為下一步試驗的功能探究奠定基礎(chǔ)。

4 小結(jié)

本研究成功分離純化培養(yǎng)得到湖羊的乳腺上皮細胞，經(jīng)免疫熒光技術(shù)鑒定其為陽性，并且狀態(tài)良好，可以確定所獲得的細胞為湖羊乳腺上皮細胞。