劉 堯， 劉 成 晟， 成 艷， 陳 明

( 大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

二十二碳六烯酸(DHA)是一種重要的ω-3多不飽和脂肪酸，具有促進腦細胞發(fā)育、增強視力、預防和治療心腦血管疾病等生理功效[1]，被譽為新一代功能因子，廣泛用于食品醫(yī)藥行業(yè)。傳統(tǒng)的DHA主要來源于深海魚油，但魚油的品質(zhì)與產(chǎn)量難以滿足商業(yè)化發(fā)展需求。裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)是一種富含DHA的海洋真菌，具有生長速度快、易于培養(yǎng)、細胞內(nèi)油脂含量高等優(yōu)點，是商業(yè)化生產(chǎn)DHA的理想菌種之一，利用Schizochytriumsp.生產(chǎn)DHA已成為目前國內(nèi)外的研究熱點[2-3]。近年來，關于裂殖壺菌生產(chǎn)DHA油脂的報道更多地集中在發(fā)酵工藝和培養(yǎng)條件[4-5]，產(chǎn)量問題一直不理想。氮源對微生物菌體生長、油脂合成啟動、油脂產(chǎn)量和油脂組成等均產(chǎn)生重要影響[6-7]。本實驗利用一株Schizochytriumsp. DP-16發(fā)酵產(chǎn)DHA油脂，研究了不同氮源對DHA油脂生成的調(diào)控作用，以期為微生物發(fā)酵產(chǎn)DHA油脂的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

Schizochytriumsp. DP-16，本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，酵母浸粉10，蛋白胨2，海水晶15，pH 6.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖80，酵母浸粉5，海水晶15，MgSO4·7H2O 5，KH2PO4·H2O 7；pH 6.0。

1.1.3 試劑與儀器

葡萄糖、MgSO4·7H2O，天津大茂化學試劑廠；酵母浸粉、蛋白胨，北京奧博星生物技術有限責任公司；海水晶，山東強隆海水晶廠；KH2PO4·H2O，天津科密歐化學試劑有限公司；三氟化硼-甲醇，上海安譜科學儀器有限公司。

Agilent Technologies GC 7890氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 種子液制備

將甘油管接種于斜面后，在25 ℃條件下培養(yǎng)48 h，用接種環(huán)挑取4～5環(huán)接入裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，25 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵

按10%的接種量將種子液接入裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在25 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)96 h。

1.2.3 有機氮源對DHA油脂生成的影響

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加牛肉膏、玉米漿、蛋白胨、酵母浸粉4種有機氮源，添加量為5、10、15 g/L，測定油脂的產(chǎn)量。

1.2.4 添加谷氨酸鈉對DHA油脂生成的影響

分別添加谷氨酸鈉5、10、15 g/L，搖瓶發(fā)酵96 h，測定油脂的產(chǎn)量。

1.2.5 無機氮源對DHA油脂生成的影響

分別添加硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨3種無機氮源，添加量為0.5、1.0、1.5 g/L，搖瓶發(fā)酵96 h，測定油脂的產(chǎn)量。

1.2.6 分析方法

采用細胞干重法測生物量；采用磷酸香草醛法測油脂產(chǎn)量[8]；采用DNS法測定葡萄糖含量；采用靛酚藍分光光度法測溶氨含量[9]。

1.2.7 油脂總脂肪酸中DHA含量的測定

脂肪酸的甲酯化：在5 mL離心管中，加入發(fā)酵液1 mL和去離子水3 mL，8 000 r/min離心15 min，在離心后的沉淀中分兩次加入7 mL 1 mol/L氫氧化鈉-甲醇試劑，吸打沉淀完全后轉(zhuǎn)入50 mL磨口瓶，在70 ℃水浴條件下皂化反應30 min，反應結(jié)束后繼續(xù)加入7 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，在70 ℃水浴條件下發(fā)生甲酯化反應30 min，反應完畢后放置常溫下冷卻，繼續(xù)加入飽和氯化鈉10 mL 和正己烷試劑3 mL，搖勻后取上層有機相過膜用于氣相分析。

氣相色譜條件：HP-5MS彈性石英毛細管色譜柱(5%苯甲基硅氧烷，30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度260 ℃；FID檢測器，溫度280 ℃；載氣為氮氣，體積流量1 mL/min，進樣量1 μL，分流比1∶10；采取程序升溫：初始溫度140 ℃，維持5 min，以4 ℃/min升溫至240 ℃，維持15 min。

根據(jù)脂肪酸各成分峰面積，采用峰面積歸一法計算DHA含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機氮源對DHA油脂生成的影響

不同種類的有機氮源對產(chǎn)油微生物的生長和發(fā)酵有著不同的作用[10]。基礎發(fā)酵培養(yǎng)基分別添加質(zhì)量濃度5、10、15 g/L的牛肉膏、玉米漿、蛋白胨、酵母浸粉為有機氮源，以基礎培養(yǎng)基為對照，培養(yǎng)96 h，對生物量和油脂產(chǎn)量進行測定，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，以牛肉膏作為氮源時，油脂產(chǎn)量隨著氮源添加量的增加而下降。以玉米漿為氮源，隨著氮源添加量的增加，油脂產(chǎn)量先下降后回升，但產(chǎn)量均低于對照組，油脂產(chǎn)量整體偏低。以蛋白胨為氮源時，油脂產(chǎn)量先上升后下降。在4種氮源中，酵母浸粉促進產(chǎn)油顯著，油脂產(chǎn)量整體偏高，添加量為15 g/L時，油脂產(chǎn)量最高，相比對照組提高了16.9%。

以牛肉膏和酵母浸粉為氮源時，隨著氮源濃度的增加，生物量不斷上升，酵母浸粉作為氮源添加時，生物量上升幅度達40%；玉米漿和蛋白胨為氮源時，生物量也出現(xiàn)過不同幅度的上升，氮源濃度高更傾向于促進裂殖壺菌生物量的生成。結(jié)果表明通過有機氮源來調(diào)控裂殖壺菌等產(chǎn)油微生物產(chǎn)油是一種好的研究思路。

2.2 添加谷氨酸鈉對DHA油脂生成的影響

在添加15 g/L酵母浸粉條件下，分別添加5、10、15 g/L谷氨酸鈉，培養(yǎng)96 h，對生物量、油脂產(chǎn)量和DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)進行測定，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，在3種質(zhì)量濃度谷氨酸鈉添加條件下，油脂產(chǎn)量和DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)相比對照組分均有所提高。在添加谷氨酸鈉質(zhì)量濃度10 g/L條件下，油脂產(chǎn)量和DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)最高，分別為22.8 g/L和36.6%。添加谷氨酸鈉的生物量、油脂產(chǎn)量和DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)均高于對照組，說明谷氨酸鈉可以作為一種良好的外源添加劑促進裂殖壺菌細胞生長和油脂發(fā)酵，且應控制其添加質(zhì)量濃度。

2.3 無機氮源對DHA油脂生成的影響

陸向紅等[11]發(fā)現(xiàn)無機氮源對于產(chǎn)油微生物的生長和DHA油脂合成有作用，其中硝態(tài)氮和非硝態(tài)氮作用不同。謝辰等[12]發(fā)現(xiàn)以酵母浸粉為有機氮源，添加硝酸鈉，其菌體生物量、油脂產(chǎn)量和DHA產(chǎn)量均達到最高。本實驗中，在添加10 g/L谷氨酸鈉條件下，分別添加0.5、1.0、1.5 g/L 硝酸鈉、硫酸銨和氯化銨，培養(yǎng)96 h，對生物量、油脂產(chǎn)量和DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)進行測定，結(jié)果如圖3所示。3種無機氮源中，實驗組的油脂產(chǎn)量均低于對照組。隨著氮源濃度的增加，硝酸鈉作為無機氮源時，DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)呈先升高后下降趨勢，但均低于對照組；硫酸銨和氯化銨作為無機氮源時，DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)不斷升高，1.5 g/L達到最大，高于對照組。

(a) ρ=5 g/L

(b) ρ=10 g/L

(c) ρ=15 g/L

在3種無機氮源中，硫酸銨和氯化銨都能提高DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)，陳勝蘭等[13]發(fā)現(xiàn)添加硫酸銨能提高裂殖壺菌中不飽和脂肪酸的含量，與本實驗結(jié)果相符合。其中氯化銨作用最明顯，在質(zhì)量濃度1.5 g/L達到41.5%，比對照組提高了17.5%，其氣相譜圖如圖4所示。從圖4可以看出，DHA出峰時間在31.600 min。裂殖壺菌雖能利用一定濃度的無機氮源提高DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)，但不促進產(chǎn)油。

圖2 不同谷氨酸鈉質(zhì)量濃度下DHA油脂的發(fā)酵情況

(a) ρ=0.5 g/L

(b) ρ=1.0 g/L

(c) ρ=1.5 g/L

圖4 1.5 g/L氯化銨條件下脂肪酸組成氣相峰譜圖

2.4 不同氮源種類和濃度下油脂發(fā)酵進程的分析

取酵母浸粉15 g/L和谷氨酸鈉10 g/L復配，以初始氮源條件為對照組觀察油脂發(fā)酵進程。每12 h取樣，對發(fā)酵過程中的生物量、油脂產(chǎn)量、殘?zhí)橇亢腿馨绷窟M行測定，發(fā)酵96 h，結(jié)果如圖5所示。實驗組初始溶氨量比對照組高，氮源均在12 h被大量消耗。Ratledge等[14]研究發(fā)現(xiàn)，當?shù)聪拇M時，產(chǎn)油微生物細胞內(nèi)積累的乙酰輔酶A進入脂肪酸合成途徑，油脂開始積累。從圖5(b)可以看出，12 h前主要以菌體生長為主，油脂產(chǎn)量較少；12 h后油脂開始加速積累，微生物繼續(xù)利用碳源，至96 h，葡萄糖基本耗盡，此時生物量和油脂量達到最大，分別為52和21.7 g/L。從圖5(a)可以看出，對照組的殘?zhí)橇枯^實驗組高，生物量和油脂量遠低于實驗組。

3 結(jié) 論

在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同種類和質(zhì)量濃度的有機氮源牛肉膏、玉米漿、蛋白胨和酵母浸粉，結(jié)果表明，酵母浸粉對于裂殖壺菌產(chǎn)油促進明顯。谷氨酸鈉可以作為一種良好的外源添加劑。在3種無機氮源硝酸鈉、硫酸銨和氯化銨中，硫酸銨和氯化銨能提高DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)，裂殖壺菌雖能利用一定濃度的無機氮源提高DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)，但不促進產(chǎn)油。

(a) 對照組

(b) 實驗組

不同氮源種類和濃度下油脂發(fā)酵進程結(jié)果表明，裂殖壺菌不斷消耗碳氮源用于細胞生長和油脂合成，在15 g/L酵母浸粉和10 g/L谷氨酸鈉氮源復配條件下發(fā)酵效果較好。