李 英， 張 公 亮， 畢 景 然， 侯 紅 漫

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)是革蘭陰性菌，存在于人和動(dòng)物的糞便、自然界水和土壤中。該菌屬于條件致病菌，在特定的條件下可引起多種腸道感染疾病[1-2]。冷藏儲(chǔ)存溫度在4 ℃左右，其他非低溫耐受細(xì)菌的生長受到損害抑制，而蜂房哈夫尼菌仍能正常生長繁殖，且數(shù)量急速增加[3]，是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)、影響風(fēng)味和貯藏時(shí)間的重要因素。在真空包裝食品中，哈夫尼菌屬和沙雷氏菌屬是腸桿科菌屬的優(yōu)勢腐敗微生物[3-4]。蜂房哈夫尼菌在冷凍牛肉、生牛奶等食品腐敗期間，是一種優(yōu)勢腐敗菌，在微生物腐敗中起重要作用[5]。

由微生物分泌的在食品腐敗過程中起關(guān)鍵作用的酶包括蛋白酶或蛋白水解酶(EC 3.4)、氨基酸脫羧酶(EC 4.1.1)和脂肪酶(EC 3.1.1)[6]。蛋白酶是一類可以水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶的總稱，也是生命活動(dòng)中一類極重要的水解酶，可以水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生小肽或氨基酸[7]。根據(jù)活性中心不同，可以將蛋白酶分成四大類：絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。

目前，對(duì)氣單胞菌、假單胞菌等的胞外蛋白酶已有較深入研究[8]，嗜水氣單胞菌的胞外蛋白酶(Extracellular proteases，ECPase)是一種致病因子[9]，熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)分泌的耐熱胞外蛋白酶是影響高鈣奶品質(zhì)的重要因素之一[10]。Gill等[11]研究指出，水產(chǎn)品冷鏈流通中高水分蛋白食品的特定腐敗菌是假單胞菌屬(Pseudomonas)和希瓦氏菌屬(Shewanella)。但對(duì)蜂房哈夫尼菌是否分泌胞外蛋白酶迄今未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)蜂房哈夫尼菌產(chǎn)胞外蛋白酶進(jìn)行了初步研究，為該菌株所產(chǎn)胞外蛋白酶的進(jìn)一步分離、純化和性質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂房哈夫尼菌野生株，分離自即食海參；蛋白Marker，大連瑞真生物技術(shù)有限公司。

LB液體培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5 g，胰蛋白胨1.0 g，氯化鈉1.0 g，去離子水100 mL，pH 7.5，121 ℃滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5 g，胰蛋白胨1.0 g，氯化鈉1.0 g，瓊脂粉1.5 g，去離子水100 mL，加熱溶解，pH 7.5、121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

透析袋MD44，Solarbio；UV 2102型紫外分光光度計(jì)，島津(上海)儀器有限公司；SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀，美谷分子儀器(上海)有限公司；Sorvall ST 16R高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 蛋白酶液的制備

細(xì)菌培養(yǎng)及胞外產(chǎn)物獲得：將凍存于-80 ℃的蜂房哈夫尼菌野生株接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)16 h，采用平板劃線法在LB平板中活化2次，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)16 h備用。

將菌液按體積比1∶100轉(zhuǎn)接到新鮮的LB培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)，每4 h取樣一次(相同體積)，4 ℃、10 000 r/min離心10 min[12]，收集上清液備用。

1.3.2 硫酸銨鹽析

采用硫酸銨分級(jí)沉淀法提取胞外蛋白酶。取一定體積收集的上清液，緩慢加入硫酸銨粉末，使上清液中硫酸銨的飽和度到達(dá)20%，4 ℃下勻速攪拌30 min，靜置2 h，12 000 r/min離心10 min，分別收集上清液和沉淀；上清液中緩慢加入硫酸銨粉末至飽和度達(dá)到30%，重復(fù)以上操作，至上清液中硫酸銨的最終飽和度為70%，4 ℃勻速攪拌30 min后靜置2 h，12 000 r/min離心10 min，收集沉淀。

將收集的硫酸銨飽和度為20%、30%、40%、50%、60%、70%的沉淀用20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)重懸，離心去除不溶沉淀，重懸液分裝于8 ku透析袋，用20 mmol/l Tris-HCl (pH 8.0)、4 ℃ 過夜透析。透析后離心除去沉淀，收集得到總蛋白粗提液，于-20 ℃保存。

1.3.3 蛋白酶活力的測定

1.3.3.1 2%干酪素溶液的配制

稱取干酪素2.00 g加入10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液潤濕后，再加入70 mL Tris-HCl緩沖液，于沸水浴中加熱至酪蛋白完全溶解，用緩沖液定容至100 mL。

1.3.3.2 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將L-酪氨酸放于105 ℃烘箱中烘至恒重，準(zhǔn)確稱重 0.100 0 g于潔凈干燥的燒杯中，將6 mL 1 mol/L鹽酸加入燒杯中溶解固體，轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，加入0.2 mol/L鹽酸，將溶液定容，使L-酪氨酸的終質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL。取液體10 mL，用0.2 mol/L鹽酸溶液定容至100 mL，L-酪氨酸終質(zhì)量濃度為100 μg/mL[13]。

L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照文獻(xiàn)[14]，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.052 1x+0.002 9(R2=0.998 1)。

1.3.3.3 酶活力測定

采用福林法測定蛋白酶的活力。酶活力定義：在特定條件下1 mL酶液每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為1個(gè)酶活力單位。

1.3.4 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.4.1 最適反應(yīng)溫度

胞外蛋白酶提取液分別與底物在30、35、40、45、50、55、60 ℃中反應(yīng)，測定不同溫度條件下胞外蛋白酶的酶活力，確定最適反應(yīng)溫度。

1.3.4.2 最適反應(yīng)pH

胞外蛋白酶提取液分別與底物在pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0中反應(yīng)，測定不同pH條件下胞外蛋白酶的酶活力，確定最適反應(yīng)pH。

1.3.4.3 最適NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)

在胞外蛋白酶提取液與底物的最適反應(yīng)溫度和pH條件下，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%、0.5%的NaCl反應(yīng)。測定不同條件下蛋白酶的酶活力，確定最適NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.4.4 金屬離子對(duì)胞外蛋白酶活性的影響

在胞外蛋白酶提取液與底物的最適反應(yīng)體系中加入終濃度為10 mmol/L的Mg2+、Mn2+、Ca2+、Zn2+、K+、Fe2+和Cu2+進(jìn)行反應(yīng)，測定酶活(不加金屬離子作為空白對(duì)照)。

1.3.4.5 抑制劑對(duì)胞外蛋白酶活性的影響

在胞外蛋白酶提取液與底物的最適反應(yīng)體系中加入終濃度5 mmol/L PMSF、10 mmol/L EDTA、10 mmol/L碘乙酸，測定酶活。

1.4 紅外光譜分析

將溴化鉀固體壓制成透明的薄片，使用傅里葉紅外光譜儀掃描400～4 000 cm-1的吸收情況。將樣品與溴化鉀固體均勻混合后壓制成透明的薄片，在同樣條件下使用傅里葉紅外光譜掃描400～4 000 cm-1的吸收情況。去除溴化鉀背景即為樣品的紅外吸收光譜圖[15]。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過程均在紅外燈下進(jìn)行，以保持環(huán)境干燥。壓片壓力20 MPa，保持2～3 min。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果用(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD))表示，使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析及多重比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 蜂房哈夫尼菌生長曲線及胞外蛋白酶的分泌

采用比色法對(duì)HafniaalveiH4的生長曲線進(jìn)行測定，如圖1所示。由圖1可知，在HafniaalveiH4生長前期伴隨著胞外蛋白酶的分泌，當(dāng)培養(yǎng)16 h時(shí)，菌株生長達(dá)到穩(wěn)定期；到對(duì)數(shù)期時(shí)，檢測到最大酶活力，此后趨于穩(wěn)定狀態(tài)。由此可知，HafniaalveiH4的生長狀態(tài)決定著胞外蛋白酶的產(chǎn)生，當(dāng)菌株生長的密度較高時(shí)，胞外蛋白酶活力相應(yīng)增加；當(dāng)菌株達(dá)到生長穩(wěn)定期時(shí)，胞外蛋白酶活力達(dá)到最大。菌株培養(yǎng)時(shí)間選擇16 h。

圖1 Hafnia alvei H4的生長曲線和酶活力曲線

2.2 不同硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)提取胞外蛋白酶的酶活力

由圖2可以看出，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20%～50%時(shí)，胞外蛋白酶的活力逐漸增大；50%時(shí)胞外蛋白酶活力最大；50%～70%時(shí)，胞外蛋白酶活力逐漸降低。因此選擇硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%。

圖2 不同硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)提取胞外蛋白酶的酶活力

2.3 酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 最適反應(yīng)溫度的確定

由圖3可知，蛋白酶在30～60 ℃內(nèi)均具有催化活性，在45 ℃時(shí)蛋白酶的活力最高。因此最適反應(yīng)溫度為45 ℃。

2.3.2 最適反應(yīng)pH的確定

由圖4可知，蛋白酶在pH 6.0～11.0具有一定的活力，在pH 7.5時(shí)有最高催化活力，在pH 7.5～10.0逐漸下降，當(dāng)pH大于10時(shí)酶活力急劇下降，因此pH=7.5為最適反應(yīng)pH。

2.3.3 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶活性的影響

從圖5可以看出，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，酶活力先上升后下降，最適反應(yīng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%。

圖3 Hafnia alvei H4胞外蛋白酶的最適反應(yīng)溫度

圖4 Hafnia alvei H4胞外蛋白酶的最適反應(yīng)pH

圖5 Hafnia alvei H4胞外蛋白酶的最適反應(yīng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.3.4 金屬離子對(duì)酶活性的影響

從圖6可以看出，K+、Mg2+對(duì)酶活力沒有顯著影響；Cu2+、Zn2+、Fe2+對(duì)酶活力具有抑制作用，3種離子的抑制作用依次減弱；Ca2+、Mn2+對(duì)酶活力具有促進(jìn)作用。

2.3.5 抑制劑對(duì)酶活性的影響

由圖7可知，EDTA、碘乙酸對(duì)酶的活性幾乎沒有影響，PMSF使蛋白酶的活性降低了75.54%，表明粗酶液中可能存在活性位點(diǎn)為絲氨酸的蛋白酶。

圖6 金屬離子對(duì)Hafnia alvei H4胞外蛋白酶活力的影響

圖7 抑制劑對(duì)Hafnia alvei H4胞外蛋白酶活力的影響

2.4 紅外光譜分析

酰胺I帶的吸收峰出現(xiàn)在1 690～1 630 cm-1，酰胺峰是蛋白質(zhì)的特征吸收峰[16]。由圖8可知，此酶在1 663 cm-1有吸收峰，說明具有高級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖8 酶的紅外光譜分析

3 結(jié) 論

采用硫酸銨分級(jí)沉淀法提取HafniaalveiH4產(chǎn)生的胞外蛋白酶。結(jié)果表明，隨著菌株生長密度的增大，酶活力也不斷增大。硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%時(shí)提取的酶活力最大，酶最適反應(yīng)條件為45 ℃、pH 7.5、0.5% NaCl。Cu2+、Zn2+、Fe2+對(duì)蛋白酶活力具有抑制作用，而Ca2+、Mn2+對(duì)蛋白酶活力具有促進(jìn)作用，絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF對(duì)蛋白酶的活性具有抑制作用。紅外光譜結(jié)果表明蛋白酶中含有高級(jí)結(jié)構(gòu)。