王 迪， 王 紅 英， 李 茂 琳， 張 宇， 徐 同

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

人體在新陳代謝過程中會不斷產(chǎn)生自由基，而產(chǎn)生過多的自由基會造成諸多疾病，如神經(jīng)系統(tǒng)損害、癌癥、糖尿病、炎癥、衰老等[1-3]?？寡趸瘎┚哂星宄杂苫淖饔?。研究表明，蒙藥材中含有諸多抗氧化活性物質(zhì)，是天然抗氧化劑的重要來源[4-6]。蒙藥材各種抗氧化活性物質(zhì)提取方面的研究已經(jīng)取得很大的進(jìn)展，但當(dāng)前針對蒙藥材入藥方式方面的抗氧化活性物質(zhì)的研究國內(nèi)外還沒有相關(guān)報道。本研究針對蒙成藥劑最常用的兩種方法，即湯劑和酒劑[7]，對在治療腸道疾病、神經(jīng)性疾病和尿路感染等疾病中具有顯著療效的13種蒙藥材進(jìn)行水提和醇提，對提取液進(jìn)行體外抗氧化活性比較。并使用大腸桿菌發(fā)酵液對不同提取液進(jìn)行反應(yīng)，比較反應(yīng)前后抗氧化活性的變化，以期對13種蒙藥材提取物中的抗氧化活性成分和相關(guān)活性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化提供線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

蓽茇、當(dāng)歸、冬葵果、廣木香、沙參、漏蘆花、五靈脂、茜草、榧子、遠(yuǎn)志、金蓮花、五味子、黃精，由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院藥材科鑒定并銷售。使用時，對干燥藥材進(jìn)行粉碎，制成60目粉末。

DPPH (1，1-二苯基-2-苦肼基自由基)，上海展云化工有限公司；硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 醇提樣品的制備

準(zhǔn)確稱取3 g粉碎后的13種蒙藥材，放入三角瓶中，分別加入90 mL 65%的乙醇，在室溫條件下，160 r/min搖床中浸泡12 h后過濾。將濾液按一定梯度濃度稀釋，備用。

1.2.2 水提樣品的制備

將粉碎后的13種蒙藥材放入三角瓶中，分別加入90 mL去離子水，煮沸3 h后冷卻、過濾，合并濾液，稀釋后備用。

1.2.3 大腸桿菌發(fā)酵液的制備

將冷凍保存的菌種在LB固體培養(yǎng)基上活化，取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，35 ℃、200 r/min 的搖床中培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液離心取上清液備用。

1.2.4 大腸桿菌發(fā)酵液與提取物的反應(yīng)

將醇提液和水提液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸餾，剩余20 mL 時停止旋蒸，收集備用。分別取10 mL醇提液和水提液，加入離心后的大腸桿菌發(fā)酵液1 mL，室溫反應(yīng)6 h，測定其抗氧化活性變化。

1.3 DPPH法測定提取樣品的抗氧化活性

在5 mL試管中依次加入配好的DPPH乙醇溶液2.5 mL和1 mL各組分質(zhì)量濃度為33、3.3、0.33、0.033、0.003 3 mg/mL的醇提物和各組分質(zhì)量濃度為33、16.5、8.25、4.125、2.012 5 mg/mL 的水提物，室溫下反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀在517 nm處測定OD。同時測定2.5 mL DPPH乙醇溶液與1 mL乙醇混合后的OD和2.5 mL乙醇與各個質(zhì)量濃度樣品的混合后的OD。按照公式計算不同濃度樣品DPPH的清除率(SR)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到樣品的IC50。

SR=(A0-Ai+Aj)/A0×100%

式中：A0為DPPH乙醇溶液與乙醇混合的OD；Ai為DPPH乙醇溶液與樣品混合的OD；Aj為乙醇溶液與樣品混合的OD。

1.4 羥自由基清除法測定提取樣品的抗氧化活性

在比色管中依次加入9 mmol/L的FeSO4和水楊酸各2 mL，質(zhì)量濃度分別為33、3.3、0.33、0.033、0.003 3 mg/mL的醇提物和質(zhì)量濃度為33、16.5、8.25、4.125、2.012 5 mg/mL的水提物2 mL和8.8 mmol/L的雙氧水溶液2 mL，混合后37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀在510 nm處測定OD。計算不同質(zhì)量濃度樣品對羥自由基的清除率(R)。作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出IC50。

R=(A0-A2)/(A1-A2)×100%

式中：A0為樣品組OD，A1為以蒸餾水代替過氧化氫的對照組OD，A2為以蒸餾水代替樣品的空白對照OD。

1.5 大腸桿菌發(fā)酵液與蒙藥材提取物反應(yīng)后抗氧化活性的測定

按步驟“1.3”測定提取液反應(yīng)前后對DPPH的清除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 13種蒙藥材醇提物和水提物的抗氧化活性

2.1.1 DPPH法比較醇提物和水提物的抗氧化活性

通過DPPH法測得蒙藥材醇提液的IC50如圖1所示，抗氧化能力由強到弱依次為五味子、遠(yuǎn)志、金蓮花、廣木香、茜草、漏蘆花、當(dāng)歸、蓽茇、五靈脂、沙參、黃精、榧子、冬葵果。

通過DPPH法測得蒙藥材水提液的IC50如圖2所示，抗氧化能力由強到弱依次為漏蘆花、金蓮花、五味子、五靈脂、廣木香、榧子、遠(yuǎn)志、當(dāng)歸、茜草、蓽茇、冬葵果、黃精、沙參。

圖1 DPPH法測定蒙藥材醇提物的抗氧化活性比較

圖2 DPPH法測定蒙藥材水提物的抗氧化活性

由圖1、2可知，五味子醇提液和水提液均具有較強的抗氧化活性，五味子中含有較多的木脂素和多糖，五味子中木脂素和多糖類可能是抗氧化活性物質(zhì)的主要來源。對比了蔣軍輝等[9]對五味子抗氧化活性物質(zhì)的研究(IC50=7.60 mg/mL)，本實驗使用的方法提取的抗氧化物活性更高(IC50=5.80 mg/mL)。漏蘆花、金蓮花水提物較醇提物具有更強的抗氧化活性。

2.2.2 羥自由基清除法測定醇提物和水提物抗氧化性

通過羥自由基清除法測得蒙藥材醇提液的IC50如圖3所示，其抗氧化能力由強到弱依次為五味子、當(dāng)歸、金蓮花、榧子、遠(yuǎn)志、黃精、廣木香、五靈脂、蓽茇、沙參、冬葵果、漏蘆花、茜草。

圖3 羥自由基清除法測定蒙藥材醇提物的抗氧化活性

通過羥自由基清除法測得蒙藥材的水提液的IC50如圖4所示，抗氧化能力由強到弱依次為漏蘆花、五味子、沙參、金蓮花、榧子、廣木香、冬葵果、當(dāng)歸、蓽茇、遠(yuǎn)志、五靈脂、茜草、黃精。

圖4 羥自由基清除法測定蒙藥材水提物的抗氧化活性

由圖3、4可知，五味子、金蓮花和榧子醇提物和水提物均對羥自由基有很強的清除作用。這與“2.1.1”中對五味子、金蓮花和榧子的抗氧化能力測定結(jié)果基本一致。通過比較不同提取液對羥自由基和DPPH自由基清除作用，發(fā)現(xiàn)榧子、金蓮花和五味子醇提物和水提物對DPPH和羥自由基均具有較強程度的清除作用。

2.4 大腸桿菌發(fā)酵液對13種蒙藥材提取液的作用

2.4.1 發(fā)酵液對醇提物的作用

將發(fā)酵液與蒙藥材醇提物進(jìn)行反應(yīng)，測定反應(yīng)前后抗氧化活性的變化，如圖5所示。黃精、當(dāng)歸、冬葵果和榧子醇提物在大腸桿菌發(fā)酵液反應(yīng)后抗氧化性得到顯著提高，其中黃精、當(dāng)歸和冬葵果尤為顯著，清除率分別提高了105.1%、97.1%和351.2%。

圖5 發(fā)酵液對蒙藥材醇提物的作用

2.4.2 發(fā)酵液對水提物的作用

將發(fā)酵液與蒙藥材水提物進(jìn)行反應(yīng)，測定反應(yīng)前后抗氧化活性的變化，如圖6所示。蓽茇、遠(yuǎn)志、五味子、黃精和沙參、冬葵果、廣木香活性在大腸桿菌發(fā)酵液反應(yīng)后抗氧化性得到提高，其中蓽茇、冬葵果和沙參尤為顯著。其中蓽茇清除率提高近10倍，冬葵果、黃精、沙參清除率分別提高了77.5%、54.2%和149.7%。

圖6 發(fā)酵液對蒙藥材醇提物的影響

3 結(jié) 論

13種蒙藥材中，榧子、金蓮花和五味子對DPPH和羥自由基均表現(xiàn)出較高的清除作用；榧子、金蓮花和五味子水提物對DPPH清除的IC50分別為17.1、12.0、4.5 mg/mL，對羥自由基清除的IC50分別為31.1、12.5、13.1 mg/mL；醇提物對DPPH清除的IC50分別24.2、14.0、5.8 mg/mL，對羥自由基清除的IC50分別為27.0、24.2、15.3 mg/mL。與大腸桿菌發(fā)酵液反應(yīng)后，黃精、榧子和當(dāng)歸醇提物和水提物的抗氧化活性均得到顯著提高；黃精、當(dāng)歸、冬葵果的醇提液和水提液對DPPH的清除率均有所提高。