呂家軒，張傳健，侯繼波，費(fèi)榮梅，王繼春

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫工程研究所，江蘇 南京 210014；3. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014；

偽狂犬病是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)感染豬、羊、牛等家畜以及多種野生動(dòng)物而引起的一種傳染病[1-2]，臨床癥狀包括發(fā)熱、瘙癢、腦脊髓炎和呼吸及神經(jīng)系統(tǒng)障礙等[3]。PRV對(duì)仔豬危害極大，對(duì)15日齡內(nèi)仔豬致死率可達(dá)100%。2000年之后，我國(guó)通過(guò)基因缺失疫苗與生物檢測(cè)技術(shù)已對(duì)PRV取得了良好的控制。但2011年以來(lái)，一種新型PRV變異株在全國(guó)多地的豬場(chǎng)中暴發(fā)流行，其毒力與傳播力顯著高于傳統(tǒng)毒株[4-5]，甚至有感染人的報(bào)道出現(xiàn)[6]，這不僅對(duì)豬場(chǎng)的傳染病防控提出嚴(yán)峻考驗(yàn)，也對(duì)公共衛(wèi)生安全形成嚴(yán)重的威脅。

疫苗是控制疫病的最有效的方式，研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)Bartha-K61株對(duì)變異株不能提供完全的保護(hù)[4]。應(yīng)用同源病毒研制的弱毒活疫苗(缺失gE/gI、gE/TK或者TK/gE/gI)能夠有效抵抗變異株攻擊[7-9]，但是其安全性還不夠高[8]。這暗示一些其他基因可調(diào)控PRV的毒力。PRVUS3基因?qū)儆趶?fù)制非必須基因，是病毒的重要毒力基因，編碼產(chǎn)物是絲/蘇氨酸激酶[10]。研究表明PRVUS3能夠降解Bcl2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(Bcl2 associated transcription factor 1，Bclaf1)進(jìn)而抑制Ⅰ型IFN反應(yīng)，減弱IFN-α抑制病毒復(fù)制的作用[11]。單純皰疹病毒1型的US3基因可下調(diào)感染細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ(major histocompatibility complex，MHC-Ⅰ)的表達(dá)，阻滯其向CD8+T細(xì)胞遞呈抗原，進(jìn)而抑制細(xì)胞免疫[12]。PRVUS3基因依靠其激酶活性，參與下調(diào)PRV感染豬睪丸(swine testis，ST)細(xì)胞表面MHC-Ⅰ的表達(dá)[13]。目前，變異株US3基因的失活對(duì)其毒力的影響還未見(jiàn)系統(tǒng)的報(bào)道。

本研究應(yīng)用細(xì)菌人工染色體技術(shù)(bacterial artificial chromosome，BAC)構(gòu)建了PRV變異株AH02LAUS3基因失活株P(guān)RV-US3mut，并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)點(diǎn)突變起始密碼子構(gòu)建的PRV-US3mut在ST細(xì)胞中復(fù)制穩(wěn)定。US3基因可能介導(dǎo)PRV感染ST細(xì)胞的早期復(fù)制，可抑制PRV感染ST細(xì)胞早期MHC-Ⅰ的mRNA轉(zhuǎn)錄，US3基因失活可降低PRV對(duì)小鼠的致病性。本研究為PRV變異株的基因缺失新靶點(diǎn)提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株、細(xì)胞和試驗(yàn)動(dòng)物

PRV AH02LA株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫工程研究所從安徽六安某豬場(chǎng)的PR發(fā)病豬分離、鑒定并保存[14]；含BACPRV-G的大腸桿菌GS1783由本實(shí)驗(yàn)室以PRV AH02LA為親本毒株制備并保存[15]；ST細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，生長(zhǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清+1%青鏈霉素)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。BALB/c小鼠購(gòu)于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)(合格證編號(hào)：NO.201929986)。

1.2 主要試劑

LATaq DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、DNA Marker、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；新生牛血清、胰酶和DMEM購(gòu)自Gibco公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

以下引物由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并由擎科生物科技(南京)有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.4 重組菌株BACPRV-G-US3mut的構(gòu)建

根據(jù)文獻(xiàn)[8]所述，應(yīng)用引物US3mut-Kan F/R，以卡那霉素(Kan)抗性基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增包含US3點(diǎn)突變起始密碼子與Kan抗性基因序列的PCR片段。PCR片段經(jīng)回收和Dpn I酶切后電轉(zhuǎn)入含BACPRV-G的感受態(tài)細(xì)胞GS1783中進(jìn)行第一輪同源重組，再經(jīng)第二輪重組，將KAN抗性基因敲除，獲得重組BAC，命名BACPRV-G-US3mut。應(yīng)用引物US3 F/R對(duì)US3基因起始密碼子突變進(jìn)行PCR和測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 重組毒株P(guān)RV-US3mut和親本恢復(fù)毒株P(guān)RVrec的獲得與鑒定

使用通用型柱式基因組DNA提取試劑盒，提取PRV AH02LA病毒基因組DNA，應(yīng)用引物H89 F/R PCR擴(kuò)增兩端帶有同源臂的gE/gI基因序列。堿裂解法提取BACPRV-G-US3mut的DNA。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將約3 μg帶有同源臂的gE/gI基因分別與2μg BACPRV-G-US3mut和BACPRV-G的DNA共轉(zhuǎn)染單層ST細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后1～2 d觀察到在紫外光(488nm)激發(fā)下不發(fā)出熒光的病毒蝕斑，經(jīng)3輪挑斑篩選，獲得純化的病毒，命名為PRV-US3mut和PRVrec。通過(guò)PCR、基因測(cè)序鑒定gE/gI基因序列是否正確。

1.6 PRV-US3mut遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

重組毒株P(guān)RV-US3mut在ST細(xì)胞上連續(xù)傳至15代，用通用型柱式基因組DNA提取試劑盒提取F15代病毒基因組DNA，應(yīng)用US3 F/R PCR擴(kuò)增US3基因序列，通過(guò)測(cè)序鑒定US3基因起始密碼子突變是否穩(wěn)定。

1.7 PRV-US3mut體外生長(zhǎng)特性測(cè)定

將重組毒株P(guān)RV-US3mut、親本毒株P(guān)RV AH02LA和親本恢復(fù)毒株P(guān)RVrec分別以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為0.001接種長(zhǎng)滿單層的ST細(xì)胞上，分別于接種后6、12、24、36、48和72 h收集培養(yǎng)物上清和細(xì)胞混合物，經(jīng)-70 ℃和37℃凍融3次后，12 000 r/min離心10 min取上清，檢測(cè)病毒的TCID50，共重復(fù)3次。使用軟件Graphpad Prism 5繪制生長(zhǎng)曲線，通過(guò)軟件SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 病毒感染ST細(xì)胞早期MHC-I轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

將PRV-US3mut和PRV AH02LA按MOI稀釋度為10接種于單層的ST細(xì)胞，置于5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育1 h后，吸去上清液，PBS洗滌3次，換成細(xì)胞維持液(含3%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)。接種后6 h收集細(xì)胞，使用Trizol試劑提取細(xì)胞RNA，采用Nanodrop 2000對(duì)RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，OD260/OD280應(yīng)介于1.9和2.1之間。隨后，采用1%甲醛變性凝膠電泳對(duì)RNA完整性進(jìn)行檢測(cè)，選取RNA質(zhì)量較高的樣品，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。使用PrimerScript TM RT Reagent Kit(TaKaRa，Japan)進(jìn)行cDNA合成。反應(yīng)體系包括反轉(zhuǎn)錄酶、寡核苷酸、RNA、引物、緩沖液和滅菌雙蒸水。反應(yīng)步驟為37 ℃水浴15 min，85 ℃反應(yīng)15 s，獲得cDNA置于-20 ℃保存。通過(guò)熒光定量試劑盒對(duì)β-actin和MHC-Ⅰ基因進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上游引物和下游引物各0.4 μL，cDNA 2.0 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL和滅菌雙蒸水6.8 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。共重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法分析基因表達(dá)并使用軟件SPSS 11.0分析顯著性差異。

1.9 PRV-US3mut對(duì)小鼠致病力測(cè)定

試驗(yàn)選取65只BALB/c小鼠，分組如表2所示。取滴度為106TCID50/mL的PRV AH02LA、PRV-US3mut和PRVrec3種毒株，倍比稀釋至10-5，取10-2～10-5進(jìn)行攻毒。攻毒組每只小鼠皮下接種0.2 mL病毒稀釋液，對(duì)照組接種等量PBS溶液。攻毒后統(tǒng)計(jì)死亡情況，連續(xù)觀察14 d。按Reed-Muench法計(jì)算PRV AH02LA、PRV-US3mut和PRVrec對(duì)小鼠的LD50。

表2 小鼠試驗(yàn)分組

2 結(jié)果

2.1 BACPRV-G-US3mut的獲得與鑒定

通過(guò)第一輪重組，將BACPRV-G的US3基因起始密碼子進(jìn)行點(diǎn)突變，同時(shí)插入KAN抗性基因作為篩選標(biāo)記。經(jīng)過(guò)氯霉素、卡那霉素抗性篩選后，得到重組BAC(BACPRV-G-US3mut-Kan)。核酸電泳結(jié)果(圖1)顯示，以BACPRV-G-US3mut-Kan為模板擴(kuò)增的US3基因序列相較于BACPRV-G的US3基因序列，條帶大小增加約1 000 bp。然后進(jìn)行第2輪重組，敲除Kan基因，PCR(圖1)和測(cè)序表明US3起始密碼子點(diǎn)突變成功。

2.2 重組毒株P(guān)RV-US3mut和親本恢復(fù)毒株P(guān)RVrec的獲得與鑒定

將帶有同源臂的gE/gI基因DNA片段，分別與BACPRV-G-US3mut和BACPRV-G的DNA共轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞，在拯救病毒的同時(shí)，將BAC中的mini-F基因替換為變異株AH02LA株的gE/gI基因序列。轉(zhuǎn)染后1 d觀察到在紫外光(488 nm)激發(fā)下不發(fā)出熒光的病毒蝕斑，經(jīng)3輪挑斑，獲得2株純化的病毒，分別命名為PRV-US3mut(圖2)與PRVrec(圖3)。PRV-US3mut與PRVrec的gE/gI基因經(jīng)PCR(圖4)和測(cè)序驗(yàn)證，與變異株AH02LA一致。

M. DL 5000 DNA Marker；1. US3；2. 插入KAN基因；3. 敲除KAN基因圖1 KAN抗性基因的插入與敲除鑒定

圖2 重組毒株P(guān)RV-US3mut純化

圖3 親本恢復(fù)毒株P(guān)RVrec純化

M. DL 8000 DNA Marker；1. gE/gI；2. PRV-US3mut；3. PRVrec圖4 重組病毒PRV-US3mut與PRVrec gE/gI基因序列PCR鑒定

2.3 PRV-US3mut遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

將PRV-US3mut在ST細(xì)胞中連續(xù)傳至15代，對(duì)F15代PRV-US3mut的US3基因進(jìn)行PCR和測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示PRV-US3mut起始密碼子仍保持點(diǎn)突變狀態(tài)。

2.4 PRV-US3mut、PRV AH02LA和PRVrec體外生長(zhǎng)特性分析

將重組毒株P(guān)RV-US3mut、親本毒株P(guān)RV AH02LA和親本恢復(fù)毒株P(guān)RVrec分別以MOI為0.001接種單層ST細(xì)胞，在指定時(shí)間點(diǎn)收集上清與細(xì)胞混合物檢測(cè)TCID50。生長(zhǎng)曲線如圖5所示，相對(duì)于親本毒株和親本恢復(fù)毒株，PRV-US3mut感染ST細(xì)胞12 h無(wú)病變發(fā)生，暗示US3基因可能參與病毒增殖的早期階段。在接種后36～48 h，3種毒株的滴度都達(dá)到峰值，PRV-US3mut的最高滴度(107.17TCID50/mL)相較于PRV AH02LA(107.63TCID50/mL，P=0.085)和PRVrec(107.37TCID50/mL，P=0.410)略有下降，但無(wú)顯著性差異。

圖5 PRV-US3mut、PRV AH02LA和PRVrec體外生長(zhǎng)特性

2.5 PRV-US3mut對(duì)ST細(xì)胞MHC-Ⅰ轉(zhuǎn)錄水平的影響

PRV-US3mut和PRV AH02LA感染ST細(xì)胞6 h通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)，MHC-Ⅰ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。如圖6所示，PRV-US3mut組的MHC-Ⅰ mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于AH02LA組(P=0.020)，但顯著低于正常細(xì)胞組，表明US3基因能夠抑制感染細(xì)胞的MHCⅠ轉(zhuǎn)錄，且有其他蛋白共同參與此過(guò)程。

注：圖中字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖6 PRV-US3mut與PRV AH02LA感染ST細(xì)胞6 hMHC-Ⅰ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平

2.6 PRV-US3mut、PRV AH02LA和PRVrec對(duì)小鼠致病力分析

如表3所示，親本毒株P(guān)RV AH02LA與親本恢復(fù)毒株P(guān)RVrec對(duì)小鼠的LD50分別為10-3.26/0.2 mL和10-3/0.2 mL。PRV-US3mut攻毒組小鼠全部存活，表明US3基因可能介導(dǎo)PRV對(duì)小鼠的致病性。

表3 小鼠死亡情況結(jié)果

3 討論

2011年以來(lái)，一種PRV變異株在我國(guó)暴發(fā)流行，變異株不僅造成仔豬發(fā)病死亡，母豬流產(chǎn)，同時(shí)對(duì)生長(zhǎng)豬和育肥豬致病力較強(qiáng)，甚至引起死亡，Bartha-K61株不能提供完全的保護(hù)力[4]，應(yīng)用同源病毒研制的弱毒活疫苗(缺失gE/gI、gE/TK或者TK/gE/gI)能對(duì)變異株提供更好的保護(hù)[7-9]，但是現(xiàn)有變異株活疫苗的安全性還不夠高，暗示存在其他基因影響PRV的毒力。PRVUS3基因?qū)儆趶?fù)制非必須基因，是重要的毒力基因。目前，變異株US3基因的失活對(duì)其毒力的影響還未見(jiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用基因工程技術(shù)將US3基因失活，探究其是否與PRV變異株毒力具有相關(guān)性，可配合原有的基因缺失弱毒疫苗進(jìn)一步降低PRV毒力。

PRV吸附并侵入靶細(xì)胞后，合成病毒成分并裝配成成熟的病毒粒子，最后釋放并感染鄰近細(xì)胞[10]。本研究中，PRV-US3mut的生長(zhǎng)曲線相較于親本毒株P(guān)RV AH02LA，毒力呈遲發(fā)型，提示US3基因可能介導(dǎo)PRV體外增殖的早期階段。PRV與細(xì)胞質(zhì)膜外表面的相應(yīng)受體結(jié)合后，釋放攜帶部分內(nèi)層間質(zhì)蛋白的核衣殼進(jìn)入胞漿，此過(guò)程中US3基因可能對(duì)核衣殼的轉(zhuǎn)運(yùn)起促進(jìn)作用。核衣殼以出芽方式從細(xì)胞核內(nèi)膜排出至核周腔，UL34基因能夠介導(dǎo)初級(jí)核衣殼與細(xì)胞核膜的融合[16]，而后核衣殼又在US3基因的作用下進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，US3基因還可增強(qiáng)UL34基因的活性[17]。有研究表明，PRVUS3基因缺失株的初級(jí)病毒粒子聚集在細(xì)胞核內(nèi)膜的內(nèi)凹處[18]。此外，US3基因誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重排和細(xì)胞延伸，從而促進(jìn)PRV向周?chē)?xì)胞擴(kuò)散[19]?；谇叭撕捅狙芯拷Y(jié)果可推斷：US3基因失活影響PRV感染細(xì)胞后核衣殼向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)以及核衣殼向細(xì)胞質(zhì)外排，進(jìn)而延緩病毒粒子組裝，同時(shí)抑制PRV向周?chē)?xì)胞擴(kuò)散。

對(duì)小鼠致病力研究發(fā)現(xiàn)，PRV-US3mut組小鼠全部存活。先前研究表明，PRVUS3基因具有多種毒力作用。US3基因可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡內(nèi)外途徑相關(guān)蛋白的活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[20]。US3基因是PRV中發(fā)現(xiàn)的唯一能夠編碼具有抗凋亡活性的基因。此外，US3基因可引起自然殺傷細(xì)胞表達(dá)的CD300a與靶細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，從而抑制自然殺傷細(xì)胞的免疫功能[21]。另有研究發(fā)現(xiàn)，US3基因通過(guò)降解Bcl-2來(lái)抑制Ⅰ型IFN反應(yīng)[11]。US3基因可下調(diào)PRV感染ST細(xì)胞表面MHC-Ⅰ基因的表達(dá)量[13]，本研究也證實(shí)，US3基因?qū)RV變異株感染ST細(xì)胞的MHC-Ⅰ基因轉(zhuǎn)錄存在抑制作用。為精確US3基因是否失活，今后的研究需通過(guò)Western blot進(jìn)行驗(yàn)證。綜上所述，US3基因?qū)Ψ翘禺愋悦庖吲c特異性免疫均有抑制作用，這在一定程度上解釋了US3基因失活減弱了PRV對(duì)小鼠的致病性，為PRV基因工程活疫苗的開(kāi)發(fā)提供了新的參考位點(diǎn)。

綜上，本研究應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建了PRV變異株US3基因失活株P(guān)RV-US3mut。生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PRV-US3mut在感染ST細(xì)胞早期(6和12 h)無(wú)病變發(fā)生，在感染ST細(xì)胞24 h之后，與親本毒株P(guān)RV AH02LA生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)相似，表明US3基因可能參與病毒增殖的早期階段。對(duì)小鼠致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)US3基因失活顯著減弱PRV對(duì)小鼠的致病性。本研究為PRV變異株的弱毒株疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。